昆虫致病真菌分离方法对于开发微生物控制剂非常重要。该协议可用于从土壤样品中分离和选择高毒力的昆虫致病真菌分离物。该技术包括致病性筛选的三个分支，并结合了耐热性和分生孢子生产测定，以做出有效的分生孢子数排名。
该方法可以帮助选择高毒力和有希望的致癌性新真菌分离物进行商业化。该协议侧重于生物控制，它也可用于发现昆虫致病真菌分离物，以研究害虫与昆虫致病真菌之间的相互作用。演示该程序的将是我实验室的刘耀嘉和倪念桐。
首先收集土壤样品，方法是去除一厘米的表层土壤，然后使用铲子从每个采样点收集5至10厘米深度的土壤。记录每个采样点的详细信息后，在室温下将100克土壤样品收集并保存到塑料袋中，以在三小时内进行真菌分离方案。为了分离潜在的昆虫致病真菌或EPF，在塑料杯中加入100克土壤样品，并在室温下在黑暗中将五种Tenebrio molitor蠕虫置于土壤表面两周，每天观察和记录幼虫死亡率和真菌病。
将死幼虫保存在杯中，直到两周进行真菌分离。两周后，将死昆虫转移到干净的长凳上，并使用无菌牙签收集分生孢子。为了获得真菌的初级培养物，在55毫米板中将收集的分生孢子在四分之一强度的Sabouraud葡萄糖琼脂培养基或SDA上划线，以在25摄氏度下孵育7天。
在第八天，在层流罩中的一个55毫米四分之一强度的SDA板上重新放置每个初级培养真菌，然后在25摄氏度下培养七天以获得真菌的单菌落。在第一次致病性筛选中，将5个Tenebrio鼹鼠幼虫直接放在每个纯真菌培养板的表面上，温度为25摄氏度。观察并记录真菌病和死亡率10天后，选择真菌分离物进行进一步分析。
要进行第二次毒力测试，通过涡旋一分钟收获每个真菌分离物的分生孢子，并使用血细胞计数器计数分生孢子的数量。完成后，在0.03%表面活性剂溶液中将分生孢子悬浮液调节到每毫升10至1/7分生孢子的浓度，然后将10微升真菌悬浮液铺展到55毫米四分之一强度的SDA板上，在黑暗中的25摄氏度下生长七天。在第八天，将五只Tenebrio鼹鼠幼虫直接放在每个纯真菌培养板的表面上，并用Parafilm薄膜密封板以孵育，同时观察真菌病和死亡率，如前所述。
在对每个真菌分离物一式三份重复第二次毒力测试后，选择分离物对目标害虫（如Spodoptera litura）进行第三次毒力测试。从七天四分之一强度的SDA板中收集约一平方毫米的EPF，以使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取真菌基因组DNA。接下来，按照文本手稿中描述的PCR程序，通过DNA样品的PCR扩增真菌内部转录的间隔物或ITS区域。
通过商业测序服务对PCR扩增产物进行测序后，使用NCBI BLAST在NCBI数据库中搜索类似的真菌，并选择相对真菌物种进行系统发育分析。对齐多个序列并使用 GeneDoc 手动修剪保守序列区域。根据最小进化、邻接连接和最大似然方法执行系统发育分析。
为了研究真菌的形态，用相机捕捉真菌培养群落的生长七天，并记录菌落的生长，形式：蓬松或坚硬，以及菌落的颜色。为了观察分生孢子团中的分生孢子，用接种环从纯培养真菌菌落中刮下分生子，并将孢子转移到含有0.1%吐温80溶液的载玻片中。使用手术刀切除真菌菌落的琼脂块，然后将琼脂块转移到载玻片上，并加入0.1%吐温80溶液以洗掉琼脂上大部分多余的分生孢子。
接下来，用盖玻片覆盖载玻片，以便对分生孢子进行光学显微镜观察。测量并记录分生孢子和分生孢子团的宽度和长度，以比较不同真菌分离物之间的差异。通过在黑暗中以约25摄氏度在四分之一强度的SDA培养基上培养选定的真菌分离物10天来安排分生孢子生产测定。
然后在0.03%表面活性剂溶液中制备一毫升真菌分离物的分生孢子悬浮液，然后如前所述将浓度调节至每毫升1/7分生孢子的1倍。在四分之一强度的SDA板上加入三滴10微升的分生孢子悬浮液后，在黑暗中以25摄氏度孵育培养物7，10和14天以计数真菌的孢子化。在每个时间点，用软木螟从菌落中心分离一个5毫米的琼脂块，并将该块转移到含有一毫升0.03%表面活性剂溶液的1.5毫升微量离心管中。
在室温下以每分钟3， 000次旋转旋转15分钟后，使用血细胞计数器计数分生孢子的数量。对于耐热性测定，培养选定的真菌分离物并制备1次10至1/7分生孢子每毫升悬浮液，如前所述。涡旋后，在45摄氏度的干浴中加热分生孢子悬浮液，间隔不同。
热暴露后，在每个时间点在55毫米四分之一强度的SDA板上加入三滴5微升的分生孢子悬浮液，然后将板在25摄氏度左右孵育18小时。为了确定发芽率，在光学显微镜下以200倍放大倍率计算发芽分生孢子的数量，并随机选择五个场。使用公式计算总有效分生孢子数或ECN，然后计算手稿中描述的真菌菌株的主成分分析或PCA。
根据ECN或PCA选择性能最佳的真菌菌株，对目标害虫进行毒力测试。在第二次毒力试验中，评估了26种真菌分离株对Tenebrio molitor黄粉虫的毒力。选取12株致病性高的真菌分离株进行针对鳞翅目蝇毒力试验。
为了更好地了解真菌分类学位置，对来自第一次致病性筛选的26个分离株进行了基于ITS区域的分子分析。通过真菌形态学观察的清洁方法，用0.1%吐温80溶液可以清楚地看到分生孢子团的结构。通过对分生孢子集落的微观观察研究了分生孢子的颜色，形状和排列。
ECN结合了每个EPF的分生孢子生产和耐热性数据。当ECN值高时，观察到真菌菌株的高活力。此外，还揭示了常设仲裁法院和ECN之间的良好协调，这表明ECN可用于评估可行性相关参数的层次结构。
提取真菌DNA和培养真菌分离物的致病性筛选在手术中很重要。通过使用ECN计算公式，可以选择理想的内部致病真菌。将不同的昆虫物种，如较大的蜡蛾和黄粉虫结合在一起，以从土壤样本中诱捕昆虫致病真菌，可能会增加昆虫致病真菌的多样性。
土壤的微生物多样性是该方案运行过程中一个非常有趣的话题。将来也可以通过该协议进一步调查。
