O método de isolamento de fungos entomopatômicos é importante para o desenvolvimento de agentes de controle microbiano. Este protocolo pode ser usado para isolar e selecionar isolados fúngicos entomopatômicos de alta virulência das amostras do solo. Esta técnica inclui três pinos de triagem de patogenicidade e combina o ensaio de produção de termotolerância e conidia para fazer o ranking efetivo de números conidia.
O método pode ajudar a selecionar alta virulência e prometendo novos isolados fúngicos entomopatômicos para comercialização. Este protocolo se concentra no controle biológico, também poderia ser usado para descobrir os isolados fúngicos entomopatômicos para estudar a interação entre pragas e fungos entomopatômicos. Demonstrando o procedimento serão Yao-Chia Liu e Nian-Tong Ni, estudante de mestrado do meu laboratório.
Comece com a coleta da amostra do solo removendo um centímetro do solo superficial e, em seguida, coletando o solo dentro da profundidade de cinco a 10 centímetros de cada local de amostragem usando uma pá. Após o registro dos detalhes de cada local de amostragem, colete e mantenha 100 gramas de amostra de solo em um saco plástico à temperatura ambiente para realizar o protocolo de isolamento fúngico dentro de três horas. Para isolar os potenciais fungos entomopatômicos, ou EPF, adicione 100 gramas da amostra do solo em um copo plástico e coloque cinco vermes molitor tenebrio na superfície do solo à temperatura ambiente no escuro por duas semanas com observação e registro da mortalidade larva e micose diariamente.
Mantenha a larva morta no copo até duas semanas para isolamento fúngico. Depois de duas semanas, transfira os insetos mortos para um banco limpo e use um palito estéril para coletar a conidia. Para obter a cultura primária dos fungos, resira a conidia coletada em um sabouraud dextrose médio ou SDA de quarto de força em uma placa de 55 milímetros para incubar a 25 graus Celsius por sete dias.
No oitavo dia, reesque cada fungo da cultura primária em uma placa SDA de 55 milímetros de quarto de força em uma capa de fluxo laminar antes de incubar a cultura a 25 graus Celsius por sete dias para obter colônias únicas de fungos. Na primeira triagem de patogenicidade, coloque cinco larvas molitores tenebrio diretamente na superfície de cada placa de cultura fúngica pura a 25 graus Celsius. Após observar e registrar a micose e mortalidade por 10 dias, selecione os isolados fúngicos para análise posterior.
Para realizar o segundo teste de virulência, colher a conidia de cada fúngico isolado por vórtice por um minuto e contar o número de conidia usando um hemocitómetro. Quando feito, ajuste a suspensão conidia a uma concentração de uma vez 10 a 1/7 conidia por mililitro em uma solução surfactante de 0,03% antes de espalhar 10 microliters de suspensão fúngica em uma placa SDA de 55 milímetros de quarto de força para crescer por sete dias a 25 graus Celsius no escuro. No oitavo dia, coloque cinco larvas tenebrio molitor diretamente na superfície de cada placa de cultura fúngica pura e sele as placas com filme parafilm para incubar enquanto observa a micose e mortalidade como descrito anteriormente.
Depois de repetir o segundo teste de virulência em triplicado para cada isolado fúngico, selecione os isolados para realizar o terceiro teste de virulência para a praga alvo como Spodoptera litura. Colete um EPF quadrado de um milímetro quadrado da placa SDA de sete dias para extrair o DNA genômico fúngico usando um kit de extração de DNA genômico fúngico. Em seguida, amplie o espaçador transcrito interno fúngico ou região its por PCR da amostra de DNA seguindo o programa PCR descrito no manuscrito do texto.
Depois de sequenciar o produto amplificado pelo PCR por serviço de sequenciamento comercial, use o NCBI BLAST para procurar fungos semelhantes no banco de dados NCBI e selecione as espécies fúngicas relativas para análise filogenética. Alinhe as várias sequências e corte manualmente a região de sequência conservada com o GeneDoc. Realize a análise filogenética com base na evolução mínima, junção do vizinho e métodos de máxima probabilidade.
Para estudar a morfologia dos fungos, capture o crescimento da colônia de cultura fúngica por sete dias com uma câmera e regise o crescimento, a forma:fofa ou firme, e a cor das colônias. Para observar a conidia em conidioforos, raspe conidia da colônia fúngica de cultura pura com um laço de inoculação e transfira os esporos para um tobogã de vidro contendo solução 0,1%Tween 80. Use um bisturi para cortar um bloco de ágar da colônia fúngica e, em seguida, transfira o bloco de ágar para um slide de vidro e adicione a solução 0,1%Tween 80 para lavar a maior parte do excesso de conidia no ágar.
Em seguida, cubra o slide com um deslizamento de cobertura para observação microscópica leve da conidia. Meça e regisse a largura e o comprimento das conidia e conidioforos para comparar a diferença entre diferentes isolados fúngicos. Organize um ensaio de produção conidial, culminando o isolado fúngico selecionado no meio SDA de quarto de resistência em cerca de 25 graus Celsius no escuro por 10 dias.
Em seguida, prepare uma suspensão conidial mililitro do isolado fúngico em solução surfactante de 0,03%, seguida ajustando a concentração para uma vezes 10 para a conidia de 1/7 por mililitro como descrito anteriormente. Depois de adicionar três gotículas de 10 microlitrais de suspensão conidial em uma placa SDA de quarto de força, incubar a cultura a 25 graus Celsius no escuro por sete, 10 e 14 dias para contar a esporulação de fungos. Em cada ponto, desprende um bloco de ágar de cinco milímetros do centro da colônia com um borer de cortiça e transfira o bloco para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro contendo um mililitro de solução surfactante de 0,03%.
Depois de vórtice do tubo a 3.000 rotações por minuto à temperatura ambiente por 15 minutos, use um hemócito para contar o número de conidia. Para o ensaio termotolerância, cultolar o fúngico selecionado e preparar uma vez 10 a 1/7 conidia por mililitro suspensão como ilustrado anteriormente. Após o vórtice, aqueça a suspensão conidial em um banho seco a 45 graus Celsius para diferentes intervalos de tempo.
Pós exposição ao calor, adicione três gotículas de cinco microliters de suspensão conidial em uma placa SDA de 55 milímetros de quarto de resistência em cada ponto de tempo e, em seguida, incubar as placas em torno de 25 graus Celsius por 18 horas. Para determinar a taxa de germinação, conte o número de esporos de conidia germinados com cinco campos selecionados aleatoriamente sob o microscópio leve a 200 vezes a ampliação. Calcule o número total efetivo de conidia ou ECN usando a fórmula e, em seguida, calcule a análise dos componentes do princípio ou PCA de cepas fúngicas como descrito no manuscrito.
Selecione as cepas fúngicas de melhor desempenho com base em ECN ou PCA para realizar o teste de virulência de pragas-alvo. No segundo teste de virulência, foi avaliada a virulência dos 26 isolados fúngicos contra tenebrio molitor mealworms. Foram selecionados 12 isolados fúngicos com alta patogenicidade para o teste de virulência contra Spodoptera litura.
Para melhor compreender as posições taxonômicas fúngicas, 26 isolados do primeiro rastreamento de patogenicidade foram submetidos à análise molecular com base na região de ITS. Através do método de limpeza das observações morfológicas de fungos, as estruturas dos conidioforos puderam ser vistas claramente com solução 0,1%Tween 80. A cor, forma e arranjo da conidia foram estudados através de observações microscópicas da colônia conidia.
A ECN combina dados de produção de conidia e termotolerância de cada EPF. Observou-se alta viabilidade de uma cepa fúngica quando o valor da ECN era alto. Além disso, foi revelada uma grande coordenação entre o PCA e a ECN, sugerindo que a ECN poderia ser utilizada para avaliar a hierarquia dos parâmetros relacionados à viabilidade.
O rastreamento de patogenicidade extraindo o DNA fúngico e culminando o isolado fúngico são importantes no procedimento. Utilizando a fórmula de cálculo ECN, os fungos patogênicos internos ideais podem ser selecionados. A combinação de diferentes espécies de insetos, como mariposa de cera maior e minhoca para atrair os fungos entomopatômicos das amostras do solo pode aumentar a diversidade de fungos entomopatômicos.
A diversidade de microrganismos do solo é um tema muito interessante durante a operação deste protocolo. Também pode ser investigado no futuro através deste protocolo.
