Il metodo per l'isolamento dei funghi entomopatogeni è importante per lo sviluppo di agenti di controllo microbico. Questo protocollo può essere utilizzato per isolare e selezionare isolati fungini entomopatogeni ad alta virulenza dai campioni di terreno. Questa tecnica include tre poli di screening della patogenicità e combina il test di termotolleranza e produzione di conidi per rendere efficace la classificazione del numero di conidi.
Il metodo può aiutare a selezionare l'alta virulenza e promettenti nuovi isolati fungini entomopatogeni per la commercializzazione. Questo protocollo si concentra sulla lotta biologica, potrebbe anche essere utilizzato per scoprire gli isolati fungini entomopatogeni per studiare l'interazione tra parassiti e funghi entomopatogeni. A dimostrare la procedura saranno Yao-Chia Liu e Nian-Tong Ni, studente master del mio laboratorio.
Inizia con la raccolta del campione di terreno rimuovendo un centimetro del terreno superficiale e quindi raccogliendo il terreno entro la profondità da cinque a 10 centimetri da ciascun sito di campionamento usando una pala. Dopo aver registrato i dettagli di ciascun sito di campionamento, raccogliere e conservare 100 grammi di campione di terreno in un sacchetto di plastica a temperatura ambiente per eseguire il protocollo di isolamento fungino entro tre ore. Per isolare i potenziali funghi entomopatogeni, o EPF, aggiungere 100 grammi del campione di terreno in un bicchiere di plastica e posizionare cinque vermi molitori Tenebrio sulla superficie del terreno a temperatura ambiente al buio per due settimane con l'osservazione e la registrazione giornaliera della mortalità delle larve e della micosi.
Tenere la larva morta nella tazza fino a due settimane per l'isolamento fungino. Dopo due settimane, trasferire gli insetti morti in una panca pulita e utilizzare uno stuzzicadenti sterile per raccogliere i conidi. Per ottenere la coltura primaria di funghi, strisciare i conidi raccolti su un mezzo di agar destrosio Sabouraud di un quarto di forza o SDA in una piastra da 55 millimetri per incubare a 25 gradi Celsius per sette giorni.
L'ottavo giorno, riposa ogni fungo di coltura primaria su una piastra SDA da 55 millimetri a forza di un quarto in una cappa a flusso laminare prima di incubare la coltura a 25 gradi Celsius per sette giorni per ottenere singole colonie di funghi. Nel primo screening della patogenicità, posizionare cinque larve di Tenebrio molitor direttamente sulla superficie di ciascuna piastra di coltura fungina pura a 25 gradi Celsius. Dopo aver osservato e registrato la micosi e la mortalità per 10 giorni, selezionare gli isolati fungini per ulteriori analisi.
Per eseguire il secondo test di virulenza, raccogliere i conidi di ciascun isolato fungino vorticosamente per un minuto e contare il numero di conidi usando un emocitometro. Al termine, regolare la sospensione di conidi a una concentrazione di una volta 10 al conidia 1/7 per millilitro in una soluzione di tensioattivo allo 0,03% prima di distribuire 10 microlitri di sospensione fungina su una piastra SDA da 55 millimetri a quattro forze per crescere per sette giorni a 25 gradi Celsius al buio. L'ottavo giorno, posizionare cinque larve di Tenebrio molitor direttamente sulla superficie di ogni piastra di coltura fungina pura e sigillare le piastre con pellicola Parafilm per incubare osservando la micosi e la mortalità come descritto prima.
Dopo aver ripetuto il secondo test di virulenza in triplice copia per ogni isolato fungino, selezionare gli isolati per eseguire il terzo test di virulenza per il parassita bersaglio come Spodoptera litura. Raccogli circa un millimetro quadrato di EPF dalla piastra SDA a sette giorni di forza di un quarto per estrarre il DNA genomico fungino utilizzando un kit di estrazione del DNA genomico fungino. Successivamente, amplificare il distanziatore interno trascritto fungino o la regione ITS mediante PCR del campione di DNA seguendo il programma PCR descritto nel manoscritto di testo.
Dopo aver sequenziato il prodotto amplificato dalla PCR tramite servizio di sequenziamento commerciale, utilizzare NCBI BLAST per cercare funghi simili nel database NCBI e selezionare le relative specie fungine per l'analisi filogenetica. Allineare le sequenze multiple e tagliare manualmente la regione della sequenza conservata con GeneDoc. Eseguire l'analisi filogenetica in base all'evoluzione minima, all'unione dei vicini e ai metodi di massima probabilità.
Per studiare la morfologia dei funghi, catturare la crescita della colonia di colture fungine per sette giorni con una fotocamera e registrare la crescita, la forma: soffice o soda e il colore delle colonie. Per osservare i conidi nei conidiofori, raschiare i conidi dalla colonia fungina di coltura pura con un anello di inoculazione e trasferire le spore in un vetrino contenente una soluzione di Tween 80 allo 0,1%. Utilizzare un bisturi per tagliare un blocco di agar della colonia fungina e quindi trasferire il blocco di agar su un vetrino e aggiungere la soluzione 0,1% Tween 80 per lavare via la maggior parte dei conidi in eccesso su agar.
Quindi, coprire la diapositiva con una scivolata di copertura per l'osservazione microscopica leggera dei conidi. Misurare e registrare la larghezza e la lunghezza dei conidi e dei conidiofori per confrontare la differenza tra diversi isolati fungini. Organizzare un saggio di produzione conidiale coltivando l'isolato fungino selezionato su un mezzo SDA a un quarto di forza a circa 25 gradi Celsius al buio per 10 giorni.
Quindi preparare una sospensione conidiale di millilitro dell'isolato fungino in soluzione di tensioattivo allo 0,03%, seguita da una regolazione della concentrazione a una volta 10 ai conidi 1/7 per millilitro come descritto in precedenza. Dopo aver aggiunto tre goccioline di 10 microlitri di sospensione conidiale su una piastra SDA a un quarto di forza, incubare la coltura a 25 gradi Celsius al buio per sette, 10 e 14 giorni per contare la sporulazione dei funghi. In ogni punto temporale, staccare un blocco di agar di cinque millimetri dal centro della colonia con una piralide di sughero e trasferire il blocco in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di soluzione di tensioattivo allo 0,03%.
Dopo aver ruotato il tubo a 3.000 rotazioni al minuto a temperatura ambiente per 15 minuti, utilizzare un emocitometro per contare il numero di conidi. Per il test di termotolleranza, coltivare l'isolato fungino selezionato e preparare una volta 10 a 1/7 di conidi per millilitro di sospensione come illustrato in precedenza. Dopo il vortice, riscaldare la sospensione conidiale in un bagno secco a 45 gradi Celsius per diversi intervalli di tempo.
Dopo l'esposizione al calore, aggiungere tre goccioline di cinque microlitri di sospensione conidiale su una piastra SDA da 55 millimetri a quarto di forza in ogni punto temporale e quindi incubare le piastre a circa 25 gradi Celsius per 18 ore. Per determinare il tasso di germinazione, contare il numero di spore di conidi germinate con cinque campi selezionati casualmente al microscopio ottico a 200 volte l'ingrandimento. Calcola il numero di conidi effettivi totali o ECN usando la formula, quindi calcola l'analisi dei componenti principali o PCA dei ceppi fungini come descritto nel manoscritto.
Selezionare i ceppi fungini più performanti in base a ECN o PCA per eseguire il test di virulenza dei parassiti bersaglio. Nel secondo test di virulenza, è stata valutata la virulenza dei 26 isolati fungini contro i vermi della farina tenebrio molitor. 12 isolati fungini ad alta patogenicità sono stati selezionati per il test di virulenza contro Spodoptera litura.
Per comprendere meglio le posizioni tassonomiche dei funghi, 26 isolati del primo screening di patogenicità sono stati sottoposti ad analisi molecolari basate sulla regione ITS. Attraverso il metodo di pulizia delle osservazioni morfologiche dei funghi, le strutture dei conidiofori potevano essere viste chiaramente con la soluzione 0,1% Tween 80. Il colore, la forma e la disposizione dei conidi sono stati studiati attraverso osservazioni microscopiche della colonia di conidi.
L'ECN combina i dati di produzione di conidi e di termotolleranza di ciascun EPF. L'elevata vitalità di un ceppo fungino è stata osservata quando il valore ECN era elevato. Inoltre, è stato rivelato un grande coordinamento tra l'APC e l'ECN, suggerendo che l'ECN potrebbe essere utilizzato per valutare la gerarchia dei parametri relativi alla vitalità.
Lo screening della patogenicità che estrae il DNA fungino e coltiva l'isolato fungino sono importanti nella procedura. Utilizzando la formula di calcolo ECN, è possibile selezionare i funghi patogeni interni ideali. La combinazione di diverse specie di insetti, come la falena della cera maggiore e il verme della farina insieme per esca i funghi entomopatogeni dai campioni di terreno potrebbe aumentare la diversità dei funghi entomopatogeni.
La diversità dei microrganismi del suolo è un argomento molto interessante durante il funzionamento di questo protocollo. Potrebbe anche essere ulteriormente studiato in futuro tramite questo protocollo.
