El método para el aislamiento de hongos entomopatógenos es importante para el desarrollo de agentes de control microbiano. Este protocolo se puede utilizar para aislar y seleccionar aislados de hongos entomopatógenos de alta virulencia de las muestras de suelo. Esta técnica incluye tres puntas de detección de patogenicidad y combina el ensayo de termotolerancia y producción de conidios para hacer la clasificación efectiva del número de conidios.
El método puede ayudar a seleccionar una alta virulencia y nuevos aislados de hongos entomopatógenos prometedores para su comercialización. Este protocolo se centra en el control biológico, también podría utilizarse para descubrir los aislados de hongos entomopatógenos para estudiar la interacción entre plagas y hongos entomopatógenos. Demostrando el procedimiento estarán Yao-Chia Liu y Nian-Tong Ni, estudiante de maestría de mi laboratorio.
Comience con la recolección de la muestra de suelo eliminando un centímetro del suelo superficial y luego recolectando el suelo dentro de la profundidad de cinco a 10 centímetros de cada sitio de muestreo usando una pala. Después de registrar los detalles de cada sitio de muestreo, recolecte y mantenga 100 gramos de muestra de suelo en una bolsa de plástico a temperatura ambiente para realizar el protocolo de aislamiento de hongos dentro de las tres horas. Para aislar los posibles hongos entomopatógenos, o EPF, agregue 100 gramos de la muestra de suelo en un vaso de plástico y coloque cinco gusanos Tenebrio molitor en la superficie del suelo a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos semanas con la observación y el registro de la mortalidad de larvas y la micosis diariamente.
Mantenga la larva muerta en la taza hasta dos semanas para el aislamiento de hongos. Después de dos semanas, transfiera los insectos muertos a un banco limpio y use un palillo estéril para recolectar los conidios. Para obtener el cultivo primario de hongos, rayar los conidios recolectados en un medio de agar dextrosa Sabouraud de un cuarto de fuerza o SDA en una placa de 55 milímetros para incubar a 25 grados Celsius durante siete días.
En el octavo día, vuelva a cosechar cada hongo de cultivo primario en una placa SDA de 55 milímetros de un cuarto de fuerza en una campana de flujo laminar antes de incubar el cultivo a 25 grados Celsius durante siete días para obtener colonias individuales de hongos. En el primer cribado de patogenicidad, coloque cinco larvas de Tenebrio molitor directamente sobre la superficie de cada placa de cultivo de hongos puros a 25 grados centígrados. Después de observar y registrar la micosis y la mortalidad durante 10 días, seleccione los aislados de hongos para un análisis posterior.
Para realizar la segunda prueba de virulencia, cosechar los conidios de cada aislado de hongos por vórtice durante un minuto y contar el número de conidios usando un hemocitómetro. Cuando haya terminado, ajuste la suspensión de conidios a una concentración de una vez 10 a 1/7 conidios por mililitro en una solución de surfactante al 0,03% antes de extender 10 microlitros de suspensión fúngica sobre una placa SDA de 55 milímetros de un cuarto de fuerza para crecer durante siete días a 25 grados Centígrados en la oscuridad. En el octavo día, coloque cinco larvas de Tenebrio molitor directamente en la superficie de cada placa de cultivo de hongos puros y selle las placas con película de Parafilm para incubar mientras observa la micosis y la mortalidad como se describió anteriormente.
Después de repetir la segunda prueba de virulencia por triplicado para cada aislado de hongos, seleccione los aislados para realizar la tercera prueba de virulencia para la plaga objetivo como Spodoptera litura. Recolecte alrededor de un milímetro cuadrado de EPF de la placa SDA de un cuarto de fuerza de siete días para extraer el ADN genómico fúngico utilizando un kit de extracción de ADN genómico fúngico. A continuación, amplifique el espaciador interno transcrito fúngico o la región ITS mediante PCR de la muestra de ADN siguiendo el programa de PCR descrito en el manuscrito de texto.
Después de secuenciar el producto amplificado por PCR mediante un servicio de secuenciación comercial, utilice el NCBI BLAST para buscar hongos similares en la base de datos del NCBI y seleccionar las especies de hongos relativas para el análisis filogenético. Alinee las múltiples secuencias y recorte la región de secuencia conservada manualmente con GeneDoc. Realizar el análisis filogenético basado en los métodos de evolución mínima, unión de vecinos y máxima verosimilitud.
Para estudiar la morfología de los hongos, capturar el crecimiento de la colonia de cultivo de hongos durante siete días con una cámara y registrar el crecimiento, la forma: esponjoso o firme, y el color de las colonias. Para observar los conidios en los conidióforos, raspe los conidios de la colonia de hongos de cultivo puro con un bucle de inoculación y transfiera las esporas a un portaobjetos de vidrio que contenga una solución de Tween 80 al 0,1%. Use un bisturí para cortar un bloque de agar de la colonia de hongos y luego transfiera el bloque de agar a un portaobjetos de vidrio y agregue la solución 0.1% Tween 80 para lavar la mayor parte del exceso de conidios en el agar.
A continuación, cubra la diapositiva con una hoja de cubierta para la observación microscópica ligera de los conidios. Mida y registre el ancho y la longitud de los conidios y conidióforos para comparar la diferencia entre los diferentes aislados de hongos. Organice un ensayo de producción conidial cultivando el aislado de hongos seleccionado en un medio SDA de un cuarto de fuerza a alrededor de 25 grados Celsius en la oscuridad durante 10 días.
Luego prepare una suspensión conidial de mililitros del aislado de hongos en solución de surfactante al 0,03% seguido de ajustar la concentración a una vez 10 a los conidios de 1/7 por mililitro como se describió anteriormente. Después de agregar tres gotas de 10 microlitros de suspensión conidial en una placa SDA de un cuarto de fuerza, incubar el cultivo a 25 grados Celsius en la oscuridad durante siete, 10 y 14 días para contar la esporulación de hongos. En cada punto temporal, separe un bloque de agar de cinco milímetros del centro de la colonia con un barrenador de corcho y transfiera el bloque a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga un mililitro de solución de surfactante al 0,03%.
Después de vórtice el tubo a 3, 000 rotaciones por minuto a temperatura ambiente durante 15 minutos, use un hemocitómetro para contar el número de conidios. Para el ensayo de termotolerancia, cultive el aislado fúngico seleccionado y prepare una vez 10 a 1/7 conidios por mililitro de suspensión como se ilustró anteriormente. Después del vórtice, caliente la suspensión conidial en un baño seco a 45 grados Centígrados durante diferentes intervalos de tiempo.
Después de la exposición al calor, agregue tres gotas de cinco microlitros de suspensión conidial en una placa SDA de 55 milímetros de un cuarto de fuerza en cada punto de tiempo y luego incube las placas a alrededor de 25 grados Celsius durante 18 horas. Para determinar la tasa de germinación, cuente el número de esporas de conidios germinados con cinco campos seleccionados al azar bajo el microscopio de luz a un aumento de 200 veces. Calcule el número total efectivo de conidios o ECN utilizando la fórmula, y luego calcule el análisis de componentes principales o PCA de cepas fúngicas como se describe en el manuscrito.
Seleccione las cepas de hongos de mejor rendimiento basadas en ECN o PCA para realizar la prueba de virulencia de las plagas objetivo. En la segunda prueba de virulencia, se evaluó la virulencia de los 26 aislados de hongos contra los gusanos de la harina de Tenebrio molitor. Se seleccionaron 12 aislados de hongos con alta patogenicidad para la prueba de virulencia contra Spodoptera litura.
Para comprender mejor las posiciones taxonómicas de hongos, 26 aislados del primer cribado de patogenicidad se sometieron a análisis moleculares basados en la región ITS. A través del método de limpieza de observaciones morfológicas de hongos, las estructuras de los conidióforos se pudieron ver claramente con la solución 0.1%Tween 80. El color, la forma y la disposición de los conidios se estudiaron a través de observaciones microscópicas de la colonia de conidios.
El ECN combina la producción de conidios y los datos de termotolerancia de cada EPF. La alta viabilidad de una cepa fúngica se observó cuando el valor de ECN fue alto. Además, se reveló una gran coordinación entre el PCA y el ECN, lo que sugiere que el ECN podría usarse para evaluar la jerarquía de parámetros relacionados con la viabilidad.
El cribado de patogenicidad extrayendo el ADN fúngico y cultivando el aislado fúngico son importantes en el procedimiento. Mediante el uso de la fórmula de cálculo ECN, se pueden seleccionar los hongos patógenos internos ideales. La combinación de diferentes especies de insectos, como la polilla de cera mayor y el gusano de la harina juntos para cebar los hongos entomopatógenos de las muestras de suelo podría aumentar la diversidad de hongos entomopatógenos.
La diversidad de microorganismos del suelo es un tema muy interesante durante el funcionamiento de este protocolo. También podría investigarse más a fondo en el futuro a través de este protocolo.
