3D 相关 FIB 铣削使冷冻透射电镜能够访问特定甚至罕见的细胞事件。允许直接在原生环境中揭示此事件的超结构。相关工作流程提高了靶向稀有细胞结构的成功率，并有助于在拥挤的细胞环境中明确识别它们。
展示该程序的将是相关冷冻电子断层扫描专家Anna Bieber和Christina Capitanio。通过获取荧光和反射“模式的宽场概览，开始细胞接种网格的冷冻荧光显微镜。然后，选择合适的带有荧光信号的网格方块。
在确保细胞和磁珠均匀分布在每个正方形的中心后，选择200个网格上的正方形，这些网格既可供FIB-SEM和TEM仪器访问，并且距离网格边缘至少三个正方形。在每个选定的网格方块上，以适当的聚焦步骤获取荧光堆栈。应使用高数值孔径物镜来提高光子计数和定位精度。
在数值孔径为0.9物镜的共聚焦显微镜上，获取步长为300纳米的堆栈并对奈奎斯特值进行过采样。记录多个颜色堆栈并将网格存储在液氮下，直到进一步使用。使用切口或方向标记来确保网格的正确方向，以便以后放置在TEM中。
将网格加载到冷冻FIB-SEM仪器中。确保铣削方向垂直于透射电镜的倾斜轴。要在网格上涂覆保护性有机金属层，请在FIB-SEM设置预定义的载物台位置使用等离子打码机和气体注入系统。
接下来，记录 SEM 网格概览并与 FLM 概览执行 2D 关联。通过手动检查记录的网格概览或使用软件包来查找网格方块。在 FLM 和 SEM 网格概览中选择并标记正方形的四个对应位置，并计算标记点之间的变换以进行 FLM-SEM 相关性。
然后，将标记放置在已获取 FLM 堆栈的相应网格正方形的中心，然后再预测它们在 SEM 视图中的位置。对于每个相关的网格正方形，在所选的FIB铣削角度拍摄低电流离子束图像，并选择具有所需位置和放大倍率的视场，以匹配荧光数据。对于 200 个网格，获取 FIB-SEM 数据以包含单个网格正方形，包括网格条。
然后，拍摄同一正方形的SEM图像，以帮助识别荧光和离子束视图中的相应磁珠。使用3D相关工具箱3D CT对原始或去卷积的3D FLM堆栈和每个位置的2D离子束视图进行配准，方法是在3D中加载相应的重新切片的3D FLM堆栈和离子束视图 CT.In 荧光数据，选择四个基准磁珠并右键单击位置列表，通过X中信号的高斯拟合来确定磁珠的3D位置， 然后，在离子束图像中选择相应的磁珠以执行初始3D相关。同样，在配准中添加更多磁珠以检查相关性的准确性。
通过检查它们在离子束图像中的预测位置与实际位置，省略一些在荧光和离子束中清晰可辨的基准磁珠。在3D CT中，可以查看均方根误差“或RMSE值，以评估相关性一致性。确保 RMSE 值较小且按定位精度顺序排列。
接下来，选择目标蜂窝信号并在 FLM 堆栈中拟合 3D 位置，然后再应用变换来预测离子束视图中的目标位置。对于每个相关正方形，将感兴趣特征的预测位置转移到FIB-SEM仪器以放置薄片铣削图案。如果每个单元格有多个信号，请将图案放置在同一薄片中以包含最大可能的兴趣点。
对薄片进行粗磨，然后进行精磨，以获得150至250纳米的最终厚度。将网格加载到透射电子显微镜中时，确保薄片方向垂直于倾斜轴。获取包含薄片的每个网格正方形的网格蒙太奇和概览，具有合适的放大倍率和曝光时间，以可视化 TEM 图像中的基准珠，而不会显着增加总电子剂量。
获取每个薄片的高分辨率 TEM 图。寄存器和 3D-2D 将 FLM 堆栈与 3D CT 中的 TEM 网格方块和薄片轮廓相关联。在 TEM 中执行 FLM 和 TEM 之间从低放大倍率到高放大倍率的相关性。转移位置后，在相关位置设置并运行倾斜系列“然后使用适当的放大倍率，散焦和总剂量，使用剂量对称倾斜方案在薄片确定的预倾斜处开始图像采集。
遵循手动或批量采集图像。在代表性分析中，显示了铣削部位的低放大倍率TEM概览，以定位感兴趣的生物学特征。后来，更高的放大倍率视图与FLM最大强度投影相关联，并设置了断层扫描采集的位置。
在采集的图像中，内吞蛋白沉积物可以在其天然环境中可视化。样品的优化非常重要。应优化网格制备，以在大多数网格正方形中具有良好的待研磨单元分布和大量可见基准磁珠。
3D相关铣削有助于揭示不同细胞过程的超微结构，例如每个细胞中自噬的逐步进展，并用于捕获新的相分离隔室。
