כרסום FIB בעל מתאם תלת-ממדי הופך אירועים סלולריים ספציפיים ואפילו נדירים לנגישים ל-Cryo-TEM. לאפשר את הגילוי של המבנה האולטרה של אירוע זה ישירות בתוך הסביבה הילידית. זרימת העבודה המתאמתית משפרת את שיעור ההצלחה של התמקדות במבנים תאיים נדירים, ומסייעת לזהות אותם באופן חד משמעי בסביבה התאית הצפופה.
המדגימות את ההליך יהיו אנה ביבר וכריסטינה קפיטניו, מומחיות בטומוגרפיה קריו-אלקטרונית מתאמת. התחל את המיקרוסקופ הקריו-פלואורסצנטי של רשתות זרעי התא על ידי רכישת סקירת שדה רחבה במצב פלואורסצנטי ומשוקף. לאחר מכן, בחר ריבועי רשת מתאימים עם אות פלואורסצנטי.
לאחר שווידאתם שהתאים והחרוזים מפוזרים באופן שווה לכיוון מרכז כל ריבוע, בחרו את הריבועים ב-200 רשתות רשת הנגישים הן למכשיר FIB-SEM והן למכשיר TEM, ומרוחקים לפחות שלושה ריבועים מקצה הרשת. בכל אחד מריבועי הרשת שנבחרו, רכשו ערימה פלואורסצנטית עם צעד ממוקד מתאים. יש להשתמש ביעדי צמצם מספריים גבוהים כדי להגדיל את ספירת הפוטונים ואת דיוק הלוקליזציה.
במיקרוסקופ קונפוקלי עם מפתח צמצם מספרי 0.9 מטרה, רכשו ערימות בגודל צעד של 300 ננומטר ודגימת יתר של ערך נייקוויסט. הקליטו ערימות צבעים מרובות ואחסנו רשתות תחת חנקן נוזלי עד לשימוש חדש. השתמש בסימני החיתוך או בכיוון כדי להבטיח כיוון נכון של הרשת לצורך מיקום מאוחר יותר ב- TEM.
טען את הרשתות לתוך מכשיר ה- FIB-SEM של cryo. ודא שכיוון הכרסום מאונך לציר ההטיה של ה- TEM. כדי לצפות את הרשתות בשכבה אורגנומטלית מגינה, השתמש בקודר פלזמה ובמערכת הזרקת גז במיקומי הבמה שהוגדרו מראש על ידי הגדרת FIB-SEM.
לאחר מכן, הקלט את סקירת רשת SEM ובצע מתאם דו-ממדי עם סקירות FLM. מצא את ריבועי הרשת על-ידי בדיקה ידנית של סקירות רשת מוקלטות או שימוש בחבילת תוכנה. בחר וסמן ארבעה מיקומים מתאימים עבור הריבועים בסקירת הרשת FLM ו- SEM וחשב את ההמרה בין הנקודות המסומנות עבור מתאם FLM-SEM.
לאחר מכן, מקם את הסמנים במרכז ריבועי הרשת המתאימים שעבורם נרכשו ערימות FLM לפני חיזוי מיקומם בתצוגת SEM. עבור כל ריבוע רשת מתואם, צלם תמונת קרן יונים בזרם נמוך בזווית הכרסום FIB לפי בחירתך ובחר שדה ראייה עם המיקום וההגדלה הרצויים התואמים את נתוני הפלואורסצנציה. עבור 200 רשתות רשת, רכוש נתוני FIB-SEM כדי לכלול ריבועי רשת בודדים, כולל סרגלי הרשת.
לאחר מכן, צלם תמונת SEM של אותו ריבוע כדי לסייע בזיהוי חרוזים מתאימים בתצוגת פלואורסצנטיות וקרן יונים. בצע רישום של מחסנית FLM תלת-ממדית גולמית או מפותלת מפותלת ותצוגת קרן יונים דו-ממדית עבור כל מיקום באמצעות ארגז הכלים למתאם תלת-ממדי, 3D CT, על ידי טעינת מחסנית ה-FLM התלת-ממדית המתאימה פרוסה מחדש ותצוגת קרן יונים בתלת-ממד CT.In את נתוני הפלואורסצנטיות, בחר ארבעה חרוזים פידוקיאליים ולחץ לחיצה ימנית על רשימת המיקומים כדי לקבוע מיקום תלת-ממדי של החרוזים באמצעות התאמת גאוס של האות ב-X, Y ו- Z.לאחר מכן, בחר את החרוזים המתאימים בתמונת קרן היונים כדי לבצע מתאם תלת-ממדי ראשוני. באופן דומה, הוסף חרוזים נוספים לרישום כדי לבדוק את דיוק הקורלציה.
השמיט כמה חרוזים פידוקיאליים הניתנים לזיהוי ברור הן בפלואורסצנטיות והן בקרן היונים על ידי בדיקת מיקומם החזוי לעומת המיקום בפועל בתמונת קרן היונים. ב- CT תלת ממדי, ניתן לצפות בערכי שורש ממוצעים בריבוע "או RMSE, כדי להעריך את עקביות המתאם. ודא שערכי RMSE קטנים ובסדר הדיוק של לוקליזציה.
לאחר מכן, בחר את האותות הסלולריים המיועדים והתאם את המיקום התלת-ממדי בערימת FLM לפני החלת הטרנספורמציה כדי לחזות את מיקומי המטרה בתצוגת קרן יונים. עבור כל ריבוע מתואם, העבר את המיקומים החזויים של התכונות המעניינות למכשיר FIB-SEM כדי למקם את תבניות כרסום הלמלה. אם יש מספר אותות לכל תא, מקם את הדפוסים כך שיכללו את מקסימום נקודות העניין האפשריות באותה למלה.
טחינה גסה את lamellas ואחריו כרסום עדין כדי לקבל עובי סופי של 150 עד 250 ננומטר. ודא שכיוון הלמלה מאונך לציר ההטיה בעת טעינת הרשתות למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. רכוש מונטאז' רשת וסקירות עבור כל ריבוע רשת המכיל lamellas עם הגדלה מתאימה וזמן חשיפה כדי להמחיש את החרוזים fiducial בתמונות TEM מבלי להוסיף באופן משמעותי את מינון האלקטרונים הכולל.
רכוש מפות TEM ברזולוציה גבוהה של כל lamella. Register ו- 3D-2D מתאמים את ערימת FLM עם ריבוע הרשת TEM וסקירות ה- lamella ב- CT תלת-ממדי. בצע מתאם בין FLM ו- TEM מהגדלה נמוכה לגבוהה ב- TEM. לאחר העברת המיקומים, הגדר והפעל סדרות הטיה במיקומים מתואמים", ולאחר מכן השתמש בהגדלה, ביטול מיקוד ומינון כולל מתאימים כדי להתחיל את רכישת התמונה בהטיה מראש שנקבעה על ידי הלמלה באמצעות סכימת הטיה סימטרית של מינון.
בצע רכישה ידנית או אצווה של תמונות. בניתוח המייצג, סקירת TEM בהגדלה נמוכה של אתר הכרסום מוצגת כלוקליזציה של תכונות ביולוגיות מעניינות. מאוחר יותר, תצוגת הגדלה גבוהה יותר נמצאה בקורלציה עם הקרנה בעוצמה מרבית של FLM והוגדרו מיקומים לרכישת טומוגרפיה.
בתמונות שנרכשו, ניתן היה לדמיין את מרבץ החלבון האנדוציטי בסביבתו הטבעית. אופטימיזציה של המדגם הוא מאוד חשוב. הכנת הרשת צריכה להיות אופטימלית כדי לקבל פיזור טוב של תאים לטחינה ומספר טוב של חרוזים fiducial גלוי ברוב ריבועי הרשת.
כרסום מתאם תלת-ממדי סייע לחשוף את מבנה העל של תהליכים תאיים שונים כגון התקדמות שלב אחר שלב של אוטופגיה בכל תא, והוא משמש ללכידת תא מופרד פאזה חדשני.
