3D bağıntılı FIB frezeleme, spesifik ve hatta nadir hücresel olayları Cryo-TEM için erişilebilir hale getirir. Bu olayın ultra yapısının doğrudan yerel ortamda açığa çıkmasına izin vermek. Bağıntılı iş akışı, nadir hücresel yapıları hedeflemenin başarı oranını artırır ve kalabalık hücresel ortamda bunların açık bir şekilde tanımlanmasına yardımcı olur.
Prosedürü gösteren, korelasyon kriyo-elektron tomografisinde uzman olan Anna Bieber ve Christina Capitanio olacak. Floresan ve yansıyan "modunda geniş bir alan genel bakışı elde ederek hücre tohumlu ızgaraların kriyo-floresan mikroskobuna başlayın. Ardından, floresan sinyalli uygun ızgara karelerini seçin.
Hücrelerin ve boncukların her karenin merkezine doğru eşit olarak dağıldığından emin olduktan sonra, hem FIB-SEM hem de TEM cihazı tarafından erişilebilen ve ızgara kenarından en az üç kare uzakta olan 200 gözenekli ızgaradaki kareleri seçin. Seçilen ızgara karelerinin her birinde, uygun bir odaklanmış adıma sahip bir floresan yığını elde edin. Foton sayısını ve lokalizasyon doğruluğunu artırmak için yüksek sayısal açıklık hedefleri kullanılmalıdır.
Sayısal açıklığı 0.9 objektif olan konfokal bir mikroskopta, 300 nanometre adım boyutuna sahip yığınlar elde edin ve Nyquist değerini aşırı örnekleyin. Birden fazla renk yığını kaydedin ve ızgaraları daha fazla kullanana kadar sıvı nitrojen altında saklayın. Daha sonra TEM'e yerleştirmek üzere ızgaranın doğru şekilde yönlendirilmesini sağlamak için kesme veya yönlendirme işaretlerini kullanın.
Izgaraları kriyo FIB-SEM cihazına yükleyin. Frezeleme yönünün TEM'in eğim eksenine dik olduğundan emin olun. Izgaraları koruyucu bir organometalik tabaka ile kaplamak için, FIB-SEM kurulumu tarafından önceden tanımlanmış aşama konumlarında bir plazma kodlayıcı ve gaz enjeksiyon sistemi kullanın.
Ardından, SEM ızgarasına genel bakışı kaydedin ve FLM genel bakışlarıyla bir 2B korelasyon gerçekleştirin. Kayıtlı ızgara genel bakışlarını manuel olarak inceleyerek veya bir yazılım paketi kullanarak ızgara karelerini bulun. FLM ve SEM ızgara genel görünümündeki kareler için karşılık gelen dört konumu seçin ve işaretleyin ve FLM-SEM korelasyonu için işaretli noktalar arasındaki dönüşümü hesaplayın.
Ardından, işaretçileri, SEM görünümündeki konumlarını tahmin etmeden önce FLM yığınlarının alındığı ilgili ızgara karelerinin ortasına yerleştirin. Her ilişkili ızgara karesi için, tercih edilen FIB frezeleme açısında düşük akımlı bir iyon ışını görüntüsü alın ve floresan verileriyle eşleşen istenen konum ve büyütmeye sahip bir görüş alanı seçin. 200 kafes ızgarası için, ızgara çubukları da dahil olmak üzere tek ızgara kareleri içerecek şekilde FIB-SEM verilerini alın.
Ardından, floresan ve iyon ışını görünümünde karşılık gelen boncukların tanımlanmasına yardımcı olması için aynı karenin bir SEM görüntüsünü alın. Floresan verileri CT.In karşılık gelen yeniden dilimlenmiş 3D FLM yığınını ve iyon ışını görünümünü 3D olarak yükleyerek, 3D korelasyon araç kutusu, 3D CT ile her konum için ham veya dekonvoled 3D FLM yığınının ve 2D iyon ışını görünümünün kaydını gerçekleştirin, dört referans boncuğu seçin ve sinyalin X'e Gauss uydurması yoluyla boncukların 3D konumunu belirlemek için konumlar listesine sağ tıklayın, Y ve Z.Ardından, ilk 3D korelasyonu gerçekleştirmek için iyon ışını görüntüsündeki ilgili boncukları seçin. Benzer şekilde, korelasyonun doğruluğunu kontrol etmek için kayda daha fazla boncuk ekleyin.
İyon ışını görüntüsünde tahmin edilen ve gerçek konumlarını kontrol ederek hem floresan hem de iyon ışınında açıkça tanımlanabilen bazı referans boncuklarını dışarıda bırakın. 3D CT'de, korelasyon tutarlılığını değerlendirmek için "ortalama karekök hatası" veya RMSE değerleri görüntülenebilir. RMSE değerlerinin küçük olduğundan ve yerelleştirme doğruluğu sırasına göre olduğundan emin olun.
Ardından, iyon ışını görünümünde hedef konumları tahmin etmek için dönüştürmeyi uygulamadan önce hedeflenen hücresel sinyalleri seçin ve 3B konumu FLM yığınına sığdırın. Her ilişkili kare için, lamel frezeleme modellerini yerleştirmek için ilgilenilen özelliklerin tahmin edilen konumlarını FIB-SEM cihazına aktarın. Hücre başına birden fazla sinyal varsa, desenleri aynı lameldeki mümkün olan maksimum ilgi noktalarını içerecek şekilde yerleştirin.
Lamellerin kaba frezelenmesi ve ardından 150 ila 250 nanometre nihai kalınlık elde etmek için ince frezeleme. Izgaraları transmisyon elektron mikroskobuna yüklerken lamel yönünün eğim eksenine dik olduğundan emin olun. Toplam elektron dozuna önemli ölçüde katkıda bulunmadan TEM görüntülerindeki referans boncuklarını görselleştirmek için uygun büyütme ve pozlama süresine sahip lameller içeren her ızgara karesi için ızgara montajı ve genel bakışlar elde edin.
Her lamelin yüksek çözünürlüklü TEM haritalarını edinin. Kayıt ve 3D-2D, FLM yığınını TEM ızgara karesi ve 3D CT'deki lamel genel bakışlarıyla ilişkilendirir. TEM'de FLM ve TEM arasında düşükten yükseğe doğru korelasyon gerçekleştirin. Konumları aktardıktan sonra, ilişkili konumlarda eğim serisini ayarlayın ve çalıştırın", ardından bir doz simetrik eğim şeması kullanarak lamel tarafından belirlenen ön eğimde görüntü alımını başlatmak için uygun bir büyütme, bulanıklaştırma ve toplam doz kullanın.
Görüntülerin manuel veya toplu olarak alınmasını takip edin. Temsili analizde, öğütme sahasının düşük büyütmeli TEM'e genel bakışının, ilgilenilen biyolojik özellikleri lokalize ettiği gösterilmiştir. Daha sonra, daha yüksek bir büyütme görünümü, FLM maksimum yoğunluk projeksiyonu ile ilişkilendirildi ve tomogram alımı için pozisyonlar ayarlandı.
Elde edilen görüntülerde, endositik protein birikimi doğal ortamında görselleştirilebilir. Numunenin optimizasyonu çok önemlidir. Izgara hazırlığı, öğütülecek hücrelerin iyi bir dağılımına ve çoğu ızgara karesinde çok sayıda görünür referans boncuğuna sahip olacak şekilde optimize edilmelidir.
3D bağıntılı frezeleme, her hücrede otofajinin adım adım ilerlemesi gibi farklı hücresel süreçlerin ultra yapısını ortaya çıkarmaya yardımcı oldu ve yeni bir faz ayrılmış bölmeyi yakalamak için kullanıldı.
