A fresagem FIB correlativa 3D torna eventos celulares específicos e até raros acessíveis ao Cryo-TEM. Permitindo a revelação da ultra estrutura deste evento diretamente dentro do ambiente nativo. O fluxo de trabalho correlativo melhora a taxa de sucesso de atingir estruturas celulares raras e ajuda a identificá-las inequivocamente no ambiente celular lotado.
Quem demonstrará o procedimento serão Anna Bieber e Christina Capitanio, especialistas em tomografia crioeletrônica correlativa. Comece a microscopia de criofluorescência das grades semeadas de células, adquirindo uma ampla visão geral de campo em modo fluorescência e refletido. Em seguida, selecione quadrados de grade adequados com sinal de fluorescência.
Depois de garantir que as células e contas estejam uniformemente distribuídas em direção ao centro de cada quadrado, escolha os quadrados em 200 grades de malha que sejam acessíveis tanto ao instrumento FIB-SEM quanto ao instrumento MET, e estejam a pelo menos três quadrados de distância da borda da grade. Em cada um dos quadrados de grade selecionados, adquira uma pilha fluorescente com uma etapa focada apropriada. Objetivas de alta abertura numérica devem ser usadas para aumentar a contagem de fótons e a precisão de localização.
Em um microscópio confocal com objetiva de abertura numérica 0,9, adquira pilhas com tamanho de passo de 300 nanômetros e superapele o valor de Nyquist. Registre várias pilhas de cores e armazene grades sob nitrogênio líquido até uso posterior. Use as marcas de recorte ou de orientação para garantir a orientação adequada da grade para posterior colocação no TEM.
Carregue as grades no instrumento cryo FIB-SEM. Certifique-se de que a direção da fresagem seja perpendicular ao eixo de inclinação do MET. Para revestir as grades com uma camada organometálica protetora, use um codificador de plasma e um sistema de injeção de gás nas posições de estágio pré-definidas pela configuração FIB-MEV.
Em seguida, registre a visão geral da grade do SEM e execute uma correlação 2D com as visões gerais do FLM. Encontre os quadrados de grade inspecionando manualmente as visões gerais de grade gravadas ou usando um pacote de software. Selecione e marque quatro posições correspondentes para os quadrados na visão geral da grade FLM e SEM e calcule a transformação entre os pontos marcados para correlação FLM-MEV.
Em seguida, coloque os marcadores no centro dos quadrados de grade correspondentes para os quais as pilhas FLM foram adquiridas antes de prever sua posição na visualização MEV. Para cada quadrado de grade correlacionado, pegue uma imagem de feixe de íons de baixa corrente no ângulo de fresagem FIB de escolha e selecione um campo de visão com a posição e ampliação desejadas que correspondam aos dados de fluorescência. Para 200 grades de malha, adquira dados FIB-SEM para conter quadrados de grade única, incluindo as barras de grade.
Em seguida, pegue uma imagem de MEV do mesmo quadrado para ajudar na identificação das esferas correspondentes na visão de fluorescência e feixe de íons. Execute o registro da pilha FLM 3D bruta ou desconvolizada e da visualização do feixe de íons 2D para cada posição com a caixa de ferramentas de correlação 3D, 3D CT, carregando a pilha FLM 3D fatiada correspondente e a visualização do feixe de íons em 3D CT.In os dados de fluorescência, selecione quatro contas fiduciais e clique com o botão direito do mouse na lista de posições para determinar a posição 3D das contas via encaixe gaussiano do sinal em X, Y e Z.Em seguida, selecione as contas correspondentes na imagem do feixe de íons para realizar uma correlação 3D inicial. Da mesma forma, adicione mais contas ao registro para verificar a precisão da correlação.
Deixe de fora algumas esferas fiduciais claramente identificáveis tanto na fluorescência quanto no feixe de íons, verificando sua localização prevista versus real na imagem do feixe de íons. Na TC 3D, os valores de root mean square error, ou RMSE, podem ser visualizados para avaliar a consistência da correlação. Verifique se os valores RMSE são pequenos e na ordem de precisão de localização.
Em seguida, selecione os sinais celulares de destino e ajuste a posição 3D na pilha FLM antes de aplicar a transformação para prever as posições do alvo na visualização do feixe de íons. Para cada quadrado correlacionado, transfira as posições previstas das características de interesse para o instrumento FIB-MEV para colocar os padrões de moagem de lamelas. Se houver vários sinais por célula, coloque os padrões para incluir o máximo possível de pontos de interesse na mesma lamela.
Moinho áspero das lamelas seguido de moagem fina para obter uma espessura final de 150 a 250 nanômetros. Certifique-se de que a orientação da lamela seja perpendicular ao eixo de inclinação ao carregar as grades no microscópio eletrônico de transmissão. Adquira montagem de grade e visões gerais para cada quadrado de grade contendo lamelas com ampliação e tempo de exposição adequados para visualizar as esferas fiduciais nas imagens de MET sem aumentar significativamente a dose total de elétrons.
Adquira mapas TEM de alta resolução de cada lamela. Registre e correlacione em 3D-2D a pilha FLM com o quadrado da grade TEM e as visões gerais da lamela em TC 3D. Realizar correlação entre FLM e ETM de baixa a alta magnificação em MET. Após a transferência das posições, set-up e série de inclinação de corrida em posições correlacionadas, utilizar uma magnificação, desfocagem e dose total apropriadas para iniciar a aquisição da imagem na pré-inclinação determinada pela lamela usando um esquema de inclinação simétrica de dose.
Acompanhe a aquisição manual ou em lote das imagens. Na análise representativa, a visão geral do ETM de baixa magnificação do local de moagem é mostrada para localizar características biológicas de interesse. Posteriormente, correlacionou-se uma maior magnificação com a projeção da intensidade máxima da FLM e foram estabelecidas posições para aquisição do tomograma.
Nas imagens adquiridas, o depósito proteico endocítico pôde ser visualizado em seu ambiente nativo. A otimização da amostra é muito importante. A preparação da grade deve ser otimizada para ter uma boa distribuição de células para moagem e um bom número de contas fiduciais visíveis na maioria dos quadrados da grade.
A fresagem correlativa 3D ajudou a revelar a ultraestrutura de diferentes processos celulares, como a progressão passo a passo da autofagia em cada célula, e é usada para capturar um novo compartimento separado de fase.
