3D 상관 FIB 밀링은 Cryo-TEM에서 특정 및 희귀 한 세포 이벤트에 액세스 할 수 있도록합니다. 이 이벤트의 울트라 구조를 네이티브 환경 내에서 직접 드러낼 수 있습니다. 상관 워크플로는 희귀 세포 구조를 표적으로 삼는 성공률을 높이고 혼잡한 세포 환경에서 이를 명확하게 식별하는 데 도움이 됩니다.
이 절차를 시연하는 것은 상관 극저온 전자 단층 촬영 전문가 인 Anna Bieber와 Christina Capitanio가 될 것입니다. 세포 시드 그리드의 cryo-fluorescence microscopy를 시작하여 형광 및 반사 모드에서 넓은 필드 개요를 획득합니다. 그런 다음 형광 신호가 있는 적절한 그리드 사각형을 선택합니다.
세포와 비드가 각 사각형의 중심을 향해 고르게 분포되어 있는지 확인한 후 FIB-SEM 및 TEM 기기 모두에 액세스할 수 있고 그리드 가장자리에서 최소 3개의 사각형 떨어져 있는 200개의 메쉬 그리드에서 사각형을 선택합니다. 선택한 각 그리드 사각형에서 적절한 초점 단계로 형광 스택을 획득합니다. 높은 개구수 대물렌즈는 광자 수와 위치 정확도를 높이는 데 사용해야 합니다.
개구수가 0.9인 컨포칼 현미경에서 300나노미터 스텝 크기의 스택을 획득하고 나이퀴스트 값을 오버샘플링합니다. 여러 색상 스택을 기록하고 나중에 사용할 때까지 액체 질소 아래에 그리드를 보관하십시오. 컷아웃 또는 방향 표시를 사용하여 나중에 TEM에 배치할 수 있도록 그리드의 올바른 방향을 확인합니다.
그리드를 cryo FIB-SEM 기기에 로드합니다. 밀링 방향이 TEM의 틸트 축에 수직인지 확인하십시오. 그리드를 보호 유기 금속 층으로 코팅하려면 FIB-SEM 설정에 의해 사전 정의 된 스테이지 위치에서 플라즈마 코더 및 가스 주입 시스템을 사용하십시오.
그런 다음 SEM 그리드 개요를 기록하고 FLM 개요와 2D 상관 관계를 수행합니다. 기록된 그리드 개요를 수동으로 검사하거나 소프트웨어 패키지를 사용하여 그리드 사각형을 찾습니다. FLM 및 SEM 그리드 개요에서 사각형에 해당하는 4개의 위치를 선택하여 표시하고 FLM-SEM 상관에 대해 표시된 점 간의 변환을 계산합니다.
그런 다음 SEM 뷰에서 마커의 위치를 예측하기 전에 FLM 스택을 획득한 해당 그리드 사각형의 중앙에 마커를 배치합니다. 각 상관 그리드 사각형에 대해 선택한 FIB 밀링 각도에서 저전류 이온 빔 이미지를 촬영하고 형광 데이터와 일치하는 원하는 위치 및 배율로 시야를 선택합니다. 200 메쉬 그리드의 경우 FIB-SEM 데이터를 수집하여 그리드 막대를 포함한 단일 그리드 사각형을 포함합니다.
그런 다음 동일한 사각형의 SEM 이미지를 촬영하여 형광 및 이온 빔 보기에서 해당 비드를 식별하는 데 도움이 됩니다. 3D 상관 관계 도구 상자인 3D CT를 사용하여 각 위치에 대한 원시 또는 디컨볼루션된 3D FLM 스택 및 2D 이온 빔 뷰의 정합을 수행하고, 해당 재슬라이스된 3D FLM 스택 및 이온 빔 뷰를 3D CT.In 형광 데이터로 로드하고, 4개의 기준 비드를 선택하고 위치 목록을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 X에서 신호의 가우시안 피팅을 통해 비드의 3D 위치를 결정합니다. 그런 다음 이온 빔 이미지에서 해당 비드를 선택하여 초기 3D 상관 관계를 수행합니다. 마찬가지로, 상관 관계의 정확성을 확인하기 위해 등록에 더 많은 비드를 추가합니다.
형광과 이온빔 모두에서 명확하게 식별할 수 있는 일부 기준 비드는 이온빔 이미지에서 예측된 위치와 실제 위치를 확인하여 생략합니다. 3D CT에서는 상관 관계 일관성을 평가하기 위해 평균 제곱근 오차" 또는 RMSE 값을 볼 수 있습니다. RMSE 값이 작고 지역화 정확도 정도인지 확인합니다.
다음으로, 타겟 셀룰러 신호를 선택하고 변환을 적용하기 전에 FLM 스택에 3D 위치를 피팅하여 이온 빔 뷰에서 타겟 위치를 예측합니다. 각 상관 사각형에 대해 관심 있는 특징의 예측된 위치를 FIB-SEM 기기로 전송하여 라멜라 밀링 패턴을 배치합니다. 셀당 여러 신호가 있는 경우 동일한 라멜라에 가능한 최대 관심 지점을 포함하도록 패턴을 배치합니다.
라멜라를 거칠게 밀링한 후 미세 밀링하여 150 내지 250 나노미터의 최종 두께를 얻었다. 그리드를 투과 전자 현미경에 로드할 때 라멜라 방향이 기울기 축에 수직인지 확인하십시오. 적절한 배율과 노출 시간으로 라멜라를 포함하는 각 그리드 사각형에 대한 그리드 몽타주 및 개요를 획득하여 총 전자 선량에 크게 추가하지 않고 TEM 이미지에서 기준 비드를 시각화합니다.
각 라멜라의 고해상도 TEM 맵을 획득합니다. 레지스터 및 3D-2D는 FLM 스택을 3D CT의 TEM 그리드 사각형 및 라멜라 개요와 상호 연관시킵니다. TEM에서 저배율에서 고배율까지 FLM과 TEM 간의 상관 관계를 수행합니다. 위치를 옮긴 후 상관 위치에서 틸트 시리즈를 설정하고 실행한 다음 적절한 배율, 디포커스 및 총 선량을 사용하여 선량 대칭 틸트 방식을 사용하여 라멜라에 의해 결정된 사전 기울기에서 이미지 획득을 시작합니다.
이미지의 수동 또는 일괄 수집을 따릅니다. 대표적인 분석에서, 밀링 현장의 저배율 TEM 개요는 관심있는 생물학적 특징을 국소화시키는 것으로 나타났다. 나중에 더 높은 배율 보기가 FLM 최대 강도 투영과 상관관계가 있었고 단층 촬영 위치가 설정되었습니다.
획득 된 이미지에서, endocytic 단백질 침전물은 원래 환경에서 시각화 될 수 있습니다. 샘플의 최적화는 매우 중요합니다. 그리드 준비는 밀링할 셀이 잘 분포되어 있고 대부분의 그리드 사각형에 많은 수의 기준점 비드가 보이도록 최적화되어야 합니다.
3D 상관 밀링은 각 세포에서 자가포식의 단계별 진행과 같은 다양한 세포 과정의 울트라 구조를 밝히는 데 도움이 되었으며, 새로운 상 분리 구획을 캡처하는 데 사용됩니다.
