因此，该协议使我们能够诱导TDP-43的病理相变，并解决它们在体内脊髓运动神经元中的细胞后果，这与理解为什么运动神经元在ALS中退化有关。由于斑马鱼幼虫的高透明度，脊髓中的运动神经元是直接可见的。因此，人们可以想象TDP-43在单个脊柱运动神经元中经历相变的动态行为。
该方法提供了ALS的新型动物模型。我们认为，在该ALS模型中，任何可以防止光诱导的TDP-43相变和聚集的方法都可能是ALS治疗的潜在候选者。可以表达具有内在无序区域的其他ALS相关蛋白，以探索与异常相变相关的神经毒性。
这种方法成功的关键是在无毒水平上表达脊柱运动神经元中的光遗传学TDP-43。BAC转基因是一个耗时的步骤，但是一旦你创造了一个合适的转基因鱼，以下步骤相对容易和直接。首先，使用安装在平板电脑或手机上的相关应用程序打开发光二极管或LED面板。
接下来，将光谱仪探头放入6孔培养皿的空孔中。然后使用该应用程序，将LED光调整为456nm处的峰值波长。将光功率计的光学传感器放在空井中，调整LED灯的功率。
然后将带有LED面板设置的培养皿放入28 C的培养箱中，用于表达光遗传学TDP-43的斑马鱼幼虫的成像，将双转基因鱼去角质并麻醉在含有250g / mL三氯烷的E3缓冲液中。接下来，将含有250g/mL3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸乙酯的1%低熔点温琼脂糖预热至42°C，然后将一滴琼脂糖滴在玻璃底盘上。圆顶形琼脂糖滴在玻璃盘上的直径应为8至10毫米。
接下来，使用巴斯德移液器，将麻醉的鱼加入玻璃盘上的琼脂糖中。尽量减少与鱼一起添加到琼脂糖中的E3缓冲液的量。然后，通过移液几次混合。
在琼脂糖凝固期间，使用注射器针头将鱼保持在一侧，使脊髓处于适当的水平位置。琼脂糖凝固后，在圆顶形琼脂糖安装的鱼上加入几滴E3缓冲液。使用配备20次水浸物镜的共聚焦显微镜，获取脊髓的连续共聚焦z切片。
将鱼类腹侧的泄殖腔包括在感兴趣的区域，作为识别和比较不同时间点的脊柱节段的参考。一旦成像完成，使用注射器针头小心地破解琼脂糖，并将鱼从琼脂糖中取出。保持鱼在琼脂糖中嵌入的时间尽可能短，尽管琼脂糖嵌入少于30分钟不会影响鱼的生存能力。
将7.5mL的E3缓冲液加入6孔培养皿中的一个孔中，并将成像的双转基因鱼放入该孔中。然后，将碟形天线放在LED面板上，用垫片将碟形天线和LED面板保持5毫米的距离，然后打开蓝色LED灯。将一些双转基因鱼放在一个单独的6孔培养皿中，上面覆盖着铝箔，用于未发光的控制鱼。
在所需的照明时间之后，如前所述，对被照亮的鱼的脊髓进行成像。通过分离在48处获得的z系列图像，可视化了单个脊柱运动神经元中opTDP-43h的细胞质重定位。并在受精后72小时进入每个EGFP-TDP-43z和opTDP-43h通道。
从EGFP-TDP-43z的最大强度投影图像中，单个孤立的脊柱神经元在48处都可以识别出来。并选择受精后72小时。通过追踪EGFP信号的边缘在48处来设置覆盖运动神经元体质的感兴趣区域。
受精后72小时。绘制了沿体细胞长轴的归一化荧光强度。在受精后48小时，两个信号的模式在很大程度上相互重叠。
相反，在72小时时，opTDP-43h信号的峰值在EGFP-TDP-43z信号低的区域被发现，表明opTDP-43h的细胞质重定位。为了量化蓝光刺激前后的opTDP-43h和EGFP-TDP-43z信号，在48处为相同z系列图像的每个通道生成了一些切片投影图像。受精后72小时。
在研究的四个mnr2b +细胞中，细胞1显着显示出饱和的EGFP-TDP-43z信号。opTDP-43h到EGFP-TDP-43z的相对量是通过将RFP值除以GFP值来计算的。在蓝光照射后，细胞2至4的opTDP-43h水平下降。
重要的是要尽量减少鱼嵌入琼脂糖中的时间，以保持它们的健康。通过调整LED照明的强度和持续时间，我们以临时调节的方式控制TDP-43相变，这可以帮助剖析运动神经元中病理性TDP-43相变的进展。
