Таким образом, этот протокол позволяет нам индуцировать патологические фазовые переходы TDP-43 и устранять их клеточные последствия в спинальных двигательных нейронах in vivo, что имеет отношение к пониманию того, почему двигательные нейроны дегенерируют при БАС. Благодаря высокой прозрачности личинок рыбок данио непосредственно видны двигательные нейроны в спинном мозге. Таким образом, можно визуализировать динамическое поведение TDP-43, претерпевающего фазовые переходы в одиночных спинальных двигательных нейронах.
Этот метод предлагает новую животную модель БАС. Мы считаем, что любой метод, который может предотвратить световой фазовый переход и агрегацию TDP-43 в этой модели БАС, может быть потенциальным кандидатом на терапию БАС. Другие связанные с БАС белки с внутренне неупорядоченными областями могут быть экспрессированы для изучения нейротоксичности, связанной с аномальными фазовыми переходами.
Ключом к успеху в этом подходе является экспрессия оптогенетического TDP-43 в спинномозговых двигательных нейронах на нетоксичном уровне. Трансгенез BAC является трудоемким шагом, но как только вы создадите правильную трансгенную рыбу, следующие шаги относительно проще и понятны. Для начала включите светодиод или светодиодную панель с помощью соответствующего приложения, установленного на планшете или телефоне.
Затем поместите зонд спектрометра в пустой колодец 6-луночной посуды. Затем, используя приложение, отрегулируйте светодиодный свет до длины волны, достигающей максимума в 456 нм. Поместите оптический датчик измерителя оптической мощности в пустой колодец и отрегулируйте мощность светодиодного света.
Затем поместите блюдо со светодиодной панелью в инкубатор при 28 С. Для визуализации личинок рыб данио, экспрессирующих оптогенетический TDP-43, дехорионайте двойную трансгенную рыбу и обезбольте их в буфере E3, содержащем 250 г / мл трикана. Далее разогреть 1% агарозу с низкой температурой плавления, содержащую 250 г/мл этил3-аминобензоата метансульфоната при 42 С. Затем положить каплю агарозы на стеклянную основу посуды. Диаметр куполообразной капли агарозы на стеклянной посуде должен составлять от 8 до 10 мм.
Далее, используя пипетку Пастера, добавьте обезболенную рыбу в агарозу на стеклянной посуде. Сведите к минимуму количество буфера E3, добавляемого к агарозе вместе с рыбой. Затем перемешайте путем пипетки несколько раз.
Во время затвердевания агарозы поддерживайте рыбу на боку с помощью шприцевой иглы, чтобы спинной мозг находился в соответствующем горизонтальном положении. После того, как агароза затвердеет, добавьте пару капель буфера E3 на куполообразную рыбу, установленную на агарозе. С помощью конфокального микроскопа, оснащенного 20-кратным погружением в воду объективом, приобретите серийные конфокальные Z-сечения спинного мозга.
Включите клоаку на вентральной стороне рыбы в областях, представляющих интерес, в качестве ссылки для идентификации и сравнения сегментов позвоночника в разные моменты времени. Как только визуализация будет завершена, используйте шприцевую иглу, чтобы аккуратно расколоть агарозу и удалить рыбу из агарозы. Держите количество времени, в течение которого рыба внедряется в агарозу, как можно короче, хотя встраивание агарозы менее чем на 30 минут не влияет на жизнеспособность рыбы.
Добавьте 7,5 мл буфера E3 в одну лунку блюда с 6 лунками и поместите изображенную двойную трансгенную рыбу в этот колодец. Затем поместите тарелку на светодиодную панель, удерживая тарелку и светодиодную панель на расстоянии 5 мм друг от друга с помощью распорки, и включите синий светодиодный свет. Держите немного двойной трансгенной рыбы в отдельной посуде из 6 лунок, покрытой алюминиевой фольгой для неосвещенной контрольной рыбы.
После желаемого времени освещения, изобразили спинной мозг освещенной рыбы, как показано ранее. Цитоплазматическое перемещение opTDP-43h в одиночных спинальных двигательных нейронах визуализировали путем разделения изображений z-серии, полученных в 48. и 72 часа после оплодотворения в каждый канал EGFP-TDP-43z и opTDP-43h.
Из проекционных изображений максимальной интенсивности EGFP-TDP-43z, один изолированный спинномозговой нейрон идентифицируется в обоих 48. и было выбрано 72 часа после оплодотворения. Области интереса, охватывающие сомы двигательных нейронов, были установлены путем отслеживания края сигнала EGFP на уровне 48.
и 72 часа после оплодотворения. Была построена нормализованная интенсивность флуоресценции вдоль большой оси сомы. И через 48 часов после оплодотворения паттерны обоих сигналов в значительной степени перекрывали друг друга.
Напротив, через 72 часа пик сигнала opTDP-43h был обнаружен в области, где сигнал EGFP-TDP-43z был низким, что указывает на цитоплазматическое перемещение opTDP-43h. Для количественной оценки сигналов opTDP-43h и EGFP-TDP-43z до и после стимуляции синего света были получены некоторые срезы проекционных изображений для каждого канала одних и тех же изображений z-серии при 48. и 72 часа после оплодотворения.
Из четырех исследованных ячеек mnr2b+, ячейка 1, в частности, отображала насыщенный сигнал EGFP-TDP-43z. Относительные количества opTDP-43h к EGFP-TDP-43z рассчитывались путем деления значения RFP на значение GFP. Ячейки со 2 по 4 отображали снижение уровня opTDP-43h после освещения синим светом.
Важно свести к минимуму время, в течение которого рыбы внедряются в агарозу, чтобы сохранить их здоровыми. Регулируя интенсивность и продолжительность светодиодного освещения, мы контролируем фазовый переход TDP-43 временным регулируемым образом, что может помочь рассечь прогрессирование патологического фазового перехода TDP-43 в двигательном нейроне.
