Quindi questo protocollo ci consente di indurre transizioni di fase patologiche di TDP-43 e affrontare le loro conseguenze cellulari nei motoneuroni spinali in vivo, il che è rilevante per capire perché i motoneuroni degenerano nella SLA. A causa dell'elevata trasparenza delle larve di zebrafish, i motoneuroni nel midollo spinale sono direttamente visibili. Quindi si può visualizzare il comportamento dinamico di TDP-43 in fase di transizioni in singoli motoneuroni spinali.
Questo metodo offre un nuovo modello animale di SLA. Riteniamo che qualsiasi metodo in grado di prevenire la transizione di fase e l'aggregazione di TDP-43 indotta dalla luce in questo modello di SLA possa essere un potenziale candidato per la terapia della SLA. Altre proteine correlate alla SLA con regioni intrinsecamente disordinate possono essere espresse per esplorare la neurotossicità associata alle transizioni di fase anormali.
La chiave del successo in questo approccio è esprimere il TDP-43 optogenetico nei motoneuroni spinali a livello non tossico. La transgenesi BAC è un passo che richiede tempo, ma una volta creato un pesce transgenico adeguato, i seguenti passaggi sono relativamente più facili e diretti. Per iniziare, accendere il diodo a emissione luminosa o il pannello LED utilizzando l'applicazione associata installata su un tablet o un telefono.
Quindi, posizionare la sonda dello spettrometro in un pozzo vuoto di un piatto a 6 pozzetti. Quindi, utilizzando l'applicazione, regolare la luce LED su una lunghezza d'onda con un picco di 456 nm. Posizionare il sensore ottico di un misuratore di potenza ottica nel pozzo vuoto e regolare la potenza della luce LED.
Quindi posizionare il piatto con l'impostazione del pannello LED in un incubatore a 28 C.Per l'imaging delle larve di pesce zebra che esprimono TDP-43 optogenetico, decoerniare il pesce doppio transgenico e anestetizzarli in un tampone E3 contenente 250 g / mL di Tricane. Quindi, preriscaldare l'1% di agarosio a bassa temperatura di fusione contenente 250 g / mL di etil 3-aminobenzoato metanosolfonato a 42 C.Quindi mettere una goccia di agarosio sulla piastra di base di vetro. Il diametro della goccia di agarosio a forma di cupola sul piatto di vetro dovrebbe essere compreso tra 8 e 10 mm.
Quindi, usando una pipetta Pasteur, aggiungere il pesce anestetizzato all'agarosio sul piatto a base di vetro. Ridurre al minimo la quantità di tampone E3 aggiunto all'agarosio insieme al pesce. Quindi, mescolare pipettando un paio di volte.
Durante la solidificazione dell'agarosio, mantenere il pesce su un fianco usando un ago a siringa, in modo tale che il midollo spinale sia in una posizione orizzontale appropriata. Dopo che l'agarosio si è solidificato, aggiungi un paio di gocce di tampone E3 sul pesce montato sull'agarosio a forma di cupola. Utilizzando un microscopio confocale dotato di una lente obiettivo ad immersione in acqua 20 volte, acquisire sezioni z confocali seriali del midollo spinale.
Includere la cloaca sul lato ventrale del pesce nelle regioni di interesse come riferimento per identificare e confrontare i segmenti spinali attraverso i punti temporali. Non appena l'imaging è completo, utilizzare un ago a siringa per rompere con cura l'agarosio e rimuovere il pesce dall'agarosio. Mantenere la quantità di tempo in cui il pesce è incorporato nell'agarosio il più breve possibile, anche se l'incorporamento di agarosio per meno di 30 minuti non influisce sulla vitalità del pesce.
Aggiungere 7,5 ml di tampone E3 a un pozzetto di un piatto a 6 pozzetti e posizionare il pesce doppio transgenico ripreso in quel pozzo. Quindi, posizionare il piatto sul pannello LED, mantenendo il piatto e il pannello LED a 5 mm di distanza con un distanziatore e accendere la luce LED blu. Tenere alcuni pesci a doppio transgenico in un piatto separato a 6 pozzetti coperto con un foglio di alluminio per pesci di controllo non illuminati.
Dopo il tempo di illuminazione desiderato, ha ripreso il midollo spinale del pesce illuminato come dimostrato in precedenza. Il trasferimento citoplasmatico dell'opTDP-43h in singoli motoneuroni spinali è stato visualizzato separando le immagini della serie z acquisite a 48 anni. e 72 ore dopo la fecondazione in ciascun canale EGFP-TDP-43z e opTDP-43h.
Dalle immagini di proiezione di massima intensità di EGFP-TDP-43z, un singolo neurone spinale isolato identificabile a entrambi i 48. e sono state selezionate 72 ore dopo la fecondazione. Le regioni di interesse che coprono i somi dei motoneuroni sono state impostate tracciando il bordo del segnale EGFP a 48.
e 72 ore dopo la fecondazione. L'intensità fluorescente normalizzata lungo l'asse maggiore del soma è stata tracciata. E a 48 ore dopo la fecondazione, i modelli di entrambi i segnali si sovrapponevano in gran parte l'un l'altro.
Al contrario, a 72 ore, il picco per il segnale opTDP-43h è stato trovato nella regione in cui il segnale EGFP-TDP-43z era basso, indicando il trasferimento citoplasmatico di opTDP-43h. Per quantificare i segnali opTDP-43h e EGFP-TDP-43z prima e dopo la stimolazione della luce blu, sono state prodotte a 48 alcune immagini di proiezione slice per ciascun canale delle stesse immagini della serie z. e 72 ore dopo la fecondazione.
Delle quattro celle mnr2b+ che sono state studiate, la cella 1, in particolare, ha mostrato un segnale EGFP-TDP-43z saturo. Le quantità relative di opTDP-43h a EGFP-TDP-43z sono state calcolate dividendo il valore RFP per il valore GFP. Le celle da 2 a 4 mostravano livelli di opTDP-43h decrescenti dopo l'illuminazione a luce blu.
È importante ridurre al minimo il tempo in cui i pesci sono incorporati nell'agarosio per mantenerli sani. Regolando l'intensità e la durata dell'illuminazione a LED, controlliamo la transizione di fase TDP-43 in modo regolato temporaneamente, che può aiutare a sezionare la progressione della transizione di fase patologica TDP-43 nel motoneurone.
