따라서 이 프로토콜을 통해 TDP-43의 병리학적 위상 전환을 유도하고 생체 내 척추 운동 뉴런의 세포 적 결과를 해결할 수 있으며, 이는 운동 뉴런이 ALS에서 퇴화하는 이유를 이해하는 데 관련이 있습니다. 제브라피시 애벌레의 높은 투명성으로 인해 척수의 운동 뉴런이 직접 보입니다. 따라서 단일 척추 운동 뉴런에서 단계 전이를 겪고 있는 TDP-43의 동적 동작을 시각화할 수 있습니다.
이 방법은 ALS의 새로운 동물 모델을 제공합니다. 우리는 이 ALS 모형에 있는 빛 유도한 TDP-43 상 전이 및 응집을 방지할 수 있는 어떤 방법든지 ALS 치료를 위한 잠재적인 후보가 될 수 있다는 것을 믿습니다. 본질적으로 무질서한 지구를 가진 그밖 ALS 관련 단백질은 이상한 단계 전이와 관련되었던 신경 독성을 탐구하기 위하여 표현될 수 있습니다.
이 접근법에서 성공의 열쇠는 무독성 수준에서 척추 운동 뉴런에서 광유전학 TDP-43을 표현하는 것입니다. BAC 전생은 시간이 많이 걸리는 단계이지만 적절한 형질전환 물고기를 만들면 다음 단계는 비교적 쉽고 간단합니다. 먼저 태블릿이나 휴대폰에 설치된 관련 응용 프로그램을 사용하여 발광 다이오드 또는 LED 패널을 켭니다.
다음으로 분광계 프로브를 6웰 접시의 빈 우물에 놓습니다. 그런 다음 응용 프로그램을 사용하여 LED 라이트를 456 nm에서 파장 피크로 조정합니다. 광학 전력 계의 광학 센서를 빈 우물에 놓고 LED 조명의 힘을 조절합니다.
그런 다음 28 C.에서 인큐베이터에 LED 패널 설정으로 접시를 배치하여 광유전학 TDP-43을 표현하는 얼룩말 물고기 애벌레의 이미징을 위해 이중 트랜스제닉 물고기를 데코를 선명하게 하고 트라이케인 250 g/mL를 함유한 E3 버퍼로 마취합니다. 다음으로, 에틸 3-아미노벤조이트 메탄술포네이트250g/mL를 함유한 1% 낮은 용융 온도 아가로즈를 예열한 다음 유리 베이스 디쉬에 아가로즈 한 방울을 놓습니다. 유리 접시에 돔 모양의 아가로즈 드롭의 직경은 8 ~ 10mm해야합니다.
다음으로 파스퇴르 파이펫을 사용하여 마취된 생선을 유리 기반 접시에 아가로즈에 추가합니다. 물고기와 함께 아가로즈에 추가된 E3 버퍼의 양을 최소화합니다. 그런 다음, 몇 번 파이펫으로 혼합.
아가로즈의 고화 시 척수가 적절한 수평 위치에 있도록 주사기 바늘을 사용하여 측면에 물고기를 유지합니다. 아가로즈가 고화된 후, 돔 모양의 아가로즈 장착 물고기에 E3 버퍼 몇 방울을 추가합니다. 20배의 물 침수 목표 렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 척수의 연속 공초점 z 단면을 획득합니다.
관심 지역의 물고기의 복부 쪽에 클로카를 포함하고 시간 지점에 걸쳐 척추 세그먼트를 식별하고 비교하는 참조로. 이미징이 완료되자마자 주사기 바늘을 사용하여 아가로즈를 조심스럽게 부수고 아가로즈에서 물고기를 제거하십시오. 아가로즈가 30분 미만이 포함되어 있지만 물고기의 생존가능성에 영향을 미치지 않지만, 물고기가 아가로즈에 내장되는 시간을 가능한 한 짧게 유지합니다.
7.5mL의 E3 버퍼를 6웰 접시에 넣고 이미지된 이중 트랜스제닉 생선을 잘 넣습니다. 그런 다음 접시를 LED 패널에 놓고 접시와 LED 패널을 스페이서와 5mm 떨어져 놓고 파란색 LED 조명을 켭니다. 알루미늄 호일로 덮인 별도의 6웰 요리에 이중 트랜스제닉 생선을 보관하여 비조명되지 않은 컨트롤 피쉬를 만듭니다.
원하는 조명 시간 후, 이전에 설명한 대로 조명된 물고기의 척수를 이미지했습니다. 단일 척추 운동 뉴런에서 opTDP-43h의 세포질 재배치는 48에서 획득한 z 시리즈 이미지를 분리하여 시각화되었다. 및 72시간 각 EGFP-TDP-43z 및 opTDP-43h 채널로 수정 후.
EGFP-TDP-43z의 최대 강도 프로젝션 이미지에서, 둘 다에서 식별 할 수있는 단일 고립 된 척추 뉴런 48. 및 72시간 후 수정이 선택되었다. 모터 뉴런의 소마를 덮는 관심 영역은 48에서 EGFP 신호의 가장자리를 추적하여 설정되었다.
및 72 시간 후 수정. 소마의 주요 축을 따라 정규화된 형광 강도가 플롯되었다. 그리고 48 시간 후 수정, 두 신호의 패턴은 크게 서로 겹쳤다.
대조적으로, 72시간, OPTDP-43h 신호의 피크는 EGFP-TDP-43z 신호가 낮았던 지역에서 발견되었으며, 이는 opTDP-43h의 세포질 재배치를 나타낸다. 청색광 자극 전후의 opTDP-43h 및 EGFP-TDP-43z 신호를 정량화하기 위해 동일한 z 시리즈 이미지의 각 채널에 대한 일부 슬라이스 프로젝션 이미지가 48에서 생성되었다. 및 72 시간 후 수정.
조사된 4개의 mnr2b+셀 중, 셀 1은 특히 포화 된 EGFP-TDP-43z 신호를 표시하였다. EGFP-TDP-43z에 대한 opTDP-43h의 상대적 양은 RFP 값을 GFP 값으로 나누어 계산되었다. 세포 2 ~ 4는 청색광 조명 후 opTDP-43h 수준이 감소하는 것을 나타냈다.
물고기를 건강하게 유지하기 위해 아가로즈에 내장된 시간을 최소화하는 것이 중요합니다. LED 조명의 강도와 지속 시간을 조정함으로써, 우리는 모터 뉴런에서 병리학 적 TDP-43 위상 전이의 진행을 해부 하는 데 도움이 될 수 있는 임시 규제 방식으로 TDP-43 위상 전이를 제어 합니다.
