אז פרוטוקול זה מאפשר לנו לגרום למעברי פאזה פתולוגיים של TDP-43 ולטפל בהשלכות התאיות שלהם בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה ב- vivo, אשר רלוונטי להבנה מדוע נוירונים מוטוריים מתנוונים ב- ALS. בשל השקיפות הגבוהה של זחלי דגי זברה, הנוירונים המוטוריים בחוט השדרה נראים ישירות. אז אפשר לדמיין את ההתנהגות הדינמית של TDP-43 עובר מעברי פאזה בתאי עצב מוטוריים יחידים בעמוד השדרה.
שיטה זו מציעה מודל חייתי חדשני של ALS. אנו מאמינים כי כל שיטה שיכולה למנוע את המעבר שלב TDP-43 המושרה אור וצבירה במודל ALS זה עשוי להיות מועמד פוטנציאלי לטיפול ALS. חלבונים אחרים הקשורים ALS עם אזורים עם הפרעה מהותית ניתן לבטא לחקור neurotoxicity הקשורים מעברי פאזה חריגים.
המפתח להצלחה בגישה זו הוא לבטא את TDP-43 האופטוגנטי בתאי העצב המוטוריים בעמוד השדרה ברמה הלא-טוקסיקית. BAC transgenesis הוא צעד גוזל זמן, אבל ברגע שאתה יוצר דג מהונדס תקין, השלבים הבאים הם יחסית קלים ופשוטים. כדי להתחיל, הפעל את הדיודה פולטת האור, או את החלונית LED, באמצעות היישום המשויך המותקן בטאבלט או בטלפון.
לאחר מכן, מניחים את גשושית הספקטרומטר לבאר ריקה של מנה של 6 בארות. לאחר מכן, באמצעות היישום, התאם את נורית ה- LED לאורכו גל שהגיע לשיא של 456 ננומטר. מקם את החיישן האופטי של מד כוח אופטי בבאר הריקה והתאם את עוצמת נורית ה- LED.
לאחר מכן מניחים את המנה עם הגדרת פאנל LED לתוך אינקובטור בשעה 28 C.להדמיה של זחלי דג זברה מבטא TDP-43 אופטוגנטי, dechorionate הדגים מהונדסים כפולים ומרדים אותם במאגר E3 המכיל 250 גרם / מ"ל של טריקן. לאחר מכן, לחמם 1% טמפרטורת התכה נמוכה אגרוז המכיל 250 גרם / מ"ל של אתיל 3-aminobenzoate מתנסולפונט ב 42 C.Then לשים טיפה של אגרוז על צלחת בסיס זכוכית. הקוטר של טיפת אגרוז בצורת כיפה על צלחת הזכוכית צריך להיות 8 עד 10 מ"מ.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה פסטר, מוסיפים את הדגים המנודים לאגרוז על צלחת על בסיס זכוכית. מזער את כמות חוצץ E3 הוסיף לאגרוז יחד עם הדג. לאחר מכן, לערבב על ידי צנרת כמה פעמים.
במהלך התגבשות של agarose, לשמור על הדג על הצד שלה באמצעות מחט מזרק, כך חוט השדרה נמצא במצב אופקי מתאים. לאחר האגרוז התגבש, להוסיף כמה טיפות של חוצץ E3 על דגים בצורת כיפה בצורת אגרוז. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל המצויד בעדשה אובייקטיבית טבילת מים 20 פעמים, לרכוש קטעי z קונפוקליים סדרתיים של חוט השדרה.
כלול את cloaca בצד הגחון של הדג באזורים של עניין כהתייחסות לזהות ולהשוות את מקטעי עמוד השדרה על פני נקודות הזמן. ברגע ההדמיה הושלמה, להשתמש במחט מזרק כדי לפצח בזהירות את האגורוז ולהסיר את הדג מן agarose. שמור את משך הזמן הדג מוטבע באגרוז קצר ככל האפשר, אם כי הטמעת אגרוז במשך פחות מ -30 דקות אינה משפיעה על הכדאיות של הדג.
הוסיפו 7.5 מ"ל של חוצץ E3 לבאר אחת של מנה של 6-well והכניסו את הדגים הכפולים-מהונדסים בתמונה לבאר הזו. לאחר מכן, מניחים את המנה על לוח ה-LED, שומרים על המנה ועל לוח ה-LED במרחק של 5 מ"מ זה מזה עם מרווח, והדליקו את נורית ה-LED הכחולה. שמור כמה דגים מהונדסים כפולים בצלחת נפרדת 6-באר מכוסה בנייר אלומיניום עבור דגים שליטה unilluminated.
לאחר זמן ההארה הרצוי, צילם את חוט השדרה של הדג המואר כפי שהוכח קודם לכן. רילוקיישן ציטופלסמי של opTDP-43h בתאי עצב מוטוריים יחידים בעמוד השדרה היה חזותי על ידי הפרדת תמונות סדרת z שנרכשו בגיל 48. ו-72 שעות לאחר ההפריה לכל ערוץ EGFP-TDP-43z ו-opTDP-43h.
מתמונות הקרנה בעוצמה מקסימלית של EGFP-TDP-43z, נוירון עמוד שדרה מבודד יחיד הניתן לזיהוי בשניהם 48. ו-72 שעות לאחר ההפריה נבחרו. אזורים מעניינים המכסים את הסומסה של הנוירונים המוטוריים נקבעו על ידי התחקות אחר קצה אות EGFP ב 48.
ו-72 שעות לאחר ההפריה. עוצמת הפלואורסצנטית המנורמלת לאורך הציר העיקרי של הסומה הייתה שרטטה. וב-48 שעות לאחר ההפריה, הדפוסים של שני האותות חפפו במידה רבה זה לזה.
לעומת זאת, ב 72 שעות, השיא עבור אות opTDP-43h נמצא באזור שבו האות EGFP-TDP-43z היה נמוך, המציין את המעבר הציטופלסמי של opTDP-43h. כדי לכמת את האותות opTDP-43h ו- EGFP-TDP-43z לפני ואחרי גירוי אור כחול, כמה תמונות הקרנה פרוסות עבור כל ערוץ של אותן תמונות מסדרת z הופקו בגיל 48. ו-72 שעות לאחר ההפריה.
מתוך ארבעת התאים mnr2b+שנחקרו, תא 1, הציג במיוחד אות EGFP-TDP-43z רווי. כמויות יחסיות של opTDP-43h ל- EGFP-TDP-43z חושבו על-ידי חלוקת ערך ה- RFP בערך GFP. תאים 2 עד 4 מוצגים רמות הפחתת opTDP-43h לאחר תאורת אור כחול.
חשוב למזער את הזמן שהדגים מוטבעים באגרוז כדי לשמור על בריאותם. על ידי התאמת העוצמה ומשך הזמן של תאורת LED, אנו שולטים במעבר שלב TDP-43 באופן מוסדר זמני, אשר יכול לעזור לנתח התקדמות של מעבר פאזה TDP-43 פתולוגי בנויר העצב המוטורי.
