Ce protocole nous permet donc d’induire des transitions de phase pathologiques du TDP-43 et d’aborder leurs conséquences cellulaires dans les motoneurones spinaux in vivo, ce qui est pertinent pour comprendre pourquoi les motoneurones dégénèrent dans la SLA. En raison de la grande transparence des larves de poisson zèbre, les motoneurones de la moelle épinière sont directement visibles. Ainsi, on peut visualiser le comportement dynamique du TDP-43 subissant des transitions de phase dans les motoneurones spinaux simples.
Cette méthode offre un nouveau modèle animal de la SLA. Nous croyons que toute méthode qui peut empêcher la transition de phase et l’agrégation du TDP-43 induites par la lumière dans ce modèle de SLA peut être un candidat potentiel pour le traitement de la SLA. D’autres protéines liées à la SLA avec des régions intrinsèquement désordonnées peuvent être exprimées pour explorer la neurotoxicité associée aux transitions de phase anormales.
La clé du succès de cette approche est d’exprimer le TDP-43 optogénétique dans les motoneurones spinaux au niveau non toxique. La transgénèse BAC est une étape qui prend beaucoup de temps, mais une fois que vous créez un poisson transgénique approprié, les étapes suivantes sont relativement plus faciles et directes. Pour commencer, allumez la diode électroluminescente, ou panneau LED, à l’aide de l’application associée installée sur une tablette ou un téléphone.
Ensuite, placez la sonde du spectromètre dans un puits vide d’une antenne parabolique de 6 puits. Ensuite, à l’aide de l’application, ajustez la lumière LED à une longueur d’onde culminant à 456 nm. Placez le capteur optique d’un capteur de puissance optique dans le puits vide et réglez la puissance de la lumière LED.
Placez ensuite le plat avec le réglage du panneau LED dans un incubateur à 28 C.Pour l’imagerie des larves de poisson zèbre exprimant le TDP-43 optogénétique, déchorionatez les poissons à double transgénique et anesthésiez-les dans un tampon E3 contenant 250 g / mL de Tricane. Ensuite, préchauffer 1% d’agarose à basse température de fusion contenant 250 g / mL de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate à 42 C.Ensuite, mettez une goutte d’agarose sur le plat de base en verre. Le diamètre de la goutte d’agarose en forme de dôme sur le plat en verre doit être de 8 à 10 mm.
Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, ajoutez le poisson anesthésié à l’agarose sur le plat à base de verre. Minimisez la quantité de tampon E3 ajoutée à l’agarose avec le poisson. Ensuite, mélangez en pipetant plusieurs fois.
Pendant la solidification de l’agarose, maintenez le poisson sur le côté à l’aide d’une aiguille de seringue, de sorte que la moelle épinière soit dans une position horizontale appropriée. Une fois l’agarose solidifiée, ajoutez quelques gouttes de tampon E3 sur le poisson monté sur l’agarose en forme de dôme. À l’aide d’un microscope confocal équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20 fois, acquérir des sections Z confocales en série de la moelle épinière.
Inclure le cloaque sur la face ventrale du poisson dans les régions d’intérêt comme référence pour identifier et comparer les segments de la colonne vertébrale à travers les points temporels. Dès que l’imagerie est terminée, utilisez une aiguille de seringue pour casser soigneusement l’agarose et retirer le poisson de l’agarose. Gardez la durée pendant laquelle le poisson est incrusté dans l’agarose aussi courte que possible, bien que l’incorporation de l’agarose pendant moins de 30 minutes n’affecte pas la viabilité du poisson.
Ajoutez 7,5 mL de tampon E3 à un puits d’un plat à 6 puits et placez le poisson double transgénique imagé dans ce puits. Ensuite, placez le plat sur le panneau LED, en gardant le parabole et le panneau LED à 5 mm l’un de l’autre avec une entretoise, puis allumez la lumière LED bleue. Conservez du poisson à double transgénique dans un plat séparé de 6 puits recouvert de papier d’aluminium pour les poissons témoins non éclairés.
Après le temps d’éclairage souhaité, imagez la moelle épinière du poisson illuminé comme démontré précédemment. La relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h dans les motoneurones spinaux simples a été visualisée en séparant les images de la série z acquises à 48. et 72 heures après la fertilisation dans chaque canal EGFP-TDP-43z et opTDP-43h.
À partir d’images de projection d’intensité maximale de l’EGFP-TDP-43z, un seul neurone spinal isolé identifiable aux deux 48. et 72 heures après la fécondation ont été sélectionnées. Les régions d’intérêt couvrant les somas des motoneurones ont été définies en traçant le bord du signal EGFP à 48.
et 72 heures après la fécondation. L’intensité fluorescente normalisée le long de l’axe principal du soma a été tracée. Et 48 heures après la fécondation, les modèles des deux signaux se chevauchaient largement.
En revanche, à 72 heures, le pic du signal opTDP-43h a été trouvé dans la région où le signal EGFP-TDP-43z était faible, indiquant la relocalisation cytoplasmique de l’opTDP-43h. Pour quantifier les signaux opTDP-43h et EGFP-TDP-43z avant et après la stimulation de la lumière bleue, des images de projection en tranches pour chaque canal des mêmes images de la série Z ont été produites à 48. et 72 heures après la fécondation.
Sur les quatre cellules mnr2b+ étudiées, la cellule 1 présentait notamment un signal EGFP-TDP-43z saturé. Les quantités relatives d’opTDP-43h à EGFP-TDP-43z ont été calculées en divisant la valeur de la demande de propositions par la valeur de la BPF. Les cellules 2 à 4 affichaient des niveaux d’opTDP-43h décroissants après éclairage de lumière bleue.
Il est important de minimiser le temps pendant lequel les poissons sont incrustés dans l’agarose pour les garder en bonne santé. En ajustant l’intensité et la durée de l’éclairage LED, nous contrôlons la transition de phase TDP-43 de manière régulée temporaire, ce qui peut aider à disséquer la progression de la transition de phase pathologique TDP-43 dans le motoneurone.
