该方法有助于回答表观遗传学和TET2中西5-甲基细胞素脱甲基化领域中的关键问题，例如对正常和临床TET2突变活性的分析。该技术的主要优点是，原生TET2可以在一个步骤中进行纯化，并且可以从所有三种产品的形成的角度分析其活性。几位研究生将演示这个程序。
蛋白质纯化将由查扬·巴塔查里亚、阿宁达·桑达里·戴伊的TET2测定和纳维德·阿永的LC-MS/MS分析进行。对于细菌转化，在1.7毫升管中加入含有未标记人类TET2二二氧酶的重组pDEST 14目标表达载体的微升至100微升的化学能力大肠杆菌BL21 DE3细胞中。在冰上孵育至少15分钟后，在42摄氏度的温度下将混合物在水浴中加热30秒。
热休克后立即将细胞放回冰上至少两分钟。在此之后，加入250微升的超优肉汤与代谢压抑细胞。在37摄氏度的摇床中孵育细菌细胞一小时。
孵育后，在9000倍重力下将管子离心一分钟，将细胞旋转下来。通过移液丢弃70%的上流液，并在剩余的介质中溶解颗粒。将细胞悬浮液铺在每毫升安西林含有100微克的利鲁阿肉汤加糖板上。
在37摄氏度下孵育板16小时。选择一个孤立的菌落，并接种到10毫升的LB安西林介质。在摇床中孵育管在37摄氏度过夜。
在此之后，使用100微升细菌培养剂接种100毫升LB安西林培养基作为主要培养基。在摇床中孵育管在37摄氏度过夜。第二天，接种15个烧瓶，每个含有600毫升的LB安西林介质，每个烧瓶有6毫升的原培养。
在转速为 180 RPM 的摇床上，在 37 摄氏度的温度下孵化烧瓶。要检查细菌培养的密度，请使用分光光度计测量其光学密度为 600 纳米（OD600）。在OD600时培养达到0.8的密度后，在每个烧瓶中用300微升的一摩尔IPTG诱导TET2蛋白的表达，并在17摄氏度下再培养16小时。
孵育后，将细菌培养转移到离心瓶中。将表达 TET2 酶的细菌培养力在 5，250 倍重力下离心 45 分钟。使用细菌颗粒进行 TET2 纯化。
在冰上或在4摄氏度下工作，将细菌颗粒重新悬浮在100毫升50毫升的 MES 缓冲液缓冲液中，pH6。然后服用5毫升的细胞悬浮液，并把它带到45毫升与缓冲液。在电源 20 下，以 60 秒的冷却间隔将悬架进行 5 次 30 秒的声波化。
在重力下旋转裂酸45分钟。收集含有可溶性 TET2 酶的上清液，在加载到 FPLC 系统之前，通过 0.45 微米过滤器。将 30 毫升的强阳离子交换树脂包装成 FPLC 柱。
使用 FPLC 系统以每分钟 0.3 毫升的恒定流量将柱与 10 床洗涤缓冲液平衡。将澄清的 lysate 加载到预平衡柱上，用大约 10 床的洗涤缓冲液清洗，直到流经变得清晰。Elute TET2 使用 15 个床体积中从洗涤缓冲液到洗涤缓冲液的 0 到 10% 梯度，然后是两个床体积的 10% 洗脱缓冲液的保持。
收集100微升细胞糖酸盐样品之前和之后列加载，连同所有的洗脱分数，并分析10%解析SDS-PAGE凝胶。将含有 TET2 蛋白质的分数集中，冷冻干燥蛋白质。然后将酶溶解在10毫升水中，储存在零下80摄氏度。
使用三微克基板在三钙中执行所有脱甲基反应。在总反应缓冲液的50微升中加入100微克纯化的TET2酶。在37度下孵育一小时后，用5个微升500毫升EDTA的催化氧化反应淬火。
为了准备样品进行分析，首先在55微升淬火反应中加入100微升的Oligo结合缓冲液，将DNA从TET2反应混合物中分离。在此之后，在混合物中加入400微升100%乙醇。通过 Oligo 绑定列传递此混合物。
用750微升洗涤缓冲液清洗绑定DNA后，在20微升水中洗脱DNA。现在，在37摄氏度下用两个DNase I和60个单位的S1核酸酶消化分离的DNA，12小时，产生单个核苷单磷酸盐。消化后，在样品中加入两个单位的小牛肠道碱性磷酸酶。
在37摄氏度下孵育12小时，从核苷单磷酸盐中去除末期磷酸盐组，并获得核苷酸。为LC-MS/MS方法的开发准备所有改性细胞素核苷的100微摩尔存量溶液，以及HPLC级水中的正常DNA碱基。在增强的 MS 扫描模式下，在质谱仪中逐次注入库存解决方案，以每分钟 10 微升的流速，优化核苷依赖 MS/MS 参数。
几个参数可以使用软件的自动定量优化功能针对每个DNA核苷进行优化。此时，使用流注入分析模式下软件的手动定量优化功能优化每个DNA核苷的剩余参数。现在，使用 25%溶剂 B 的梯度注入 10 微升库存溶液，以每分钟 0.3 毫升的流速，优化依赖源的 MS/MS 参数。
要分离所有八个 DNA 核苷酸，请执行 C18 列文本协议中详细说明的液相色谱。最后，在标准曲线中使用LC-MS/MS方法检测和量化所有核苷酸。由于与大多数本地大肠杆菌蛋白相比，TET2的催化领域具有相对较高的等电点，因此开发出了利用阳离子交换色谱进行高效纯化工艺。
这种纯化在一步中产生超过90%的纯TET2酶。为了分离和量化不同的脱氧核糖核酸衍生物和TET2酶反应后四个天然DNA碱基，对基于LC-MS/MS的敏感测定进行了优化。标准曲线是使用含有所有核苷的混合物的序列稀释法绘制的。
此处显示了液相色谱 MS/MS 方法的结果。该方法允许分离和定量四个正常的DNA碱基，以及四个修改的细胞氨酸碱。在这个实验过程中，我们描述了使用位点特异性重组技术和在E.Coli的目的地载体中充分表达未标记的人类TET2二氧酶催化域的克隆。
我们利用阳离子交换色谱有效纯化未标记的 TET2 酶，在一步中产生超过 90% 的纯度。此外，我们开发了一种新的液相色谱法，分离出四个正常的DNA碱基和四个改性细胞氨酸碱。为了量化 TET2 催化反应中的八个核苷酸，我们结合我们改进的液相色谱方法与串联质谱法。
然后利用敏感的LC-MS/MS测定来确定重组未标记的人类TET2酶的活性。此处描述的方法将大大提高野生型和突变的 TET2 二氧酶的估值。
