<p>我们要感谢布朗和林实验室的成员，他们在参与此视频和文章批判。这项工作是由从加拿大健康研究和迈克尔史密斯健康研究基金会研究院的资金支持。 </p>

<p class="jove_title"> DNA的提取和样品制备</p><p class="jove_content">从各种不同的样品（培养细胞，新鲜冰冻以及福尔马林固定石蜡包埋组织）的DNA可用于MeDIP。重要的是要使用不相关的蛋白质，如组蛋白高度纯化的DNA。同样重要的是删除尽可能多的RNA样品，因为它可以干扰DNA定量和抗体结合。 MeDIP使用的DNA的数量，范围可以从200毫微克至1微克，取决于可用的DNA量。为了证明这个协议，1微克的DNA将被使用。下面的协议，将提供高品质的双从培养细胞的双链DNA。应采用其他类型的样品中提取DNA的其他协议。 </p><ol><li>消化缓冲液加入400μL至1.7 mL Eppendorf管中的细胞沉淀。 </li><li>添加100微克的蛋白酶K管，并培育一夜之间在50 ° C。 </li><li>加入500μL酚pH值7和反相轻轻，但彻底混合。 </li><li>在13个000克的自旋在室温下约10分钟。 </li><li>删除一个新的管水（顶部）分数。 </li><li>重复步骤1至5 3一次。 </li><li>加入500μL1:1的酚/氯仿的pH值7和反相轻轻，但彻底混合。 </li><li>在13个000克的自旋在室温下约10分钟。 </li><li>删除一个新的管水（顶部）分数。 </li><li>添加40微克的RNA酶A孵育1小时，在37 ° C。 </li><li>加入500μL酚pH值7和反相轻轻，但彻底混合。 </li><li>在13个000克的自旋在室温下约10分钟。 </li><li>删除一个新的管水（顶部）分数。 </li><li>重复步骤13 11一次。 </li><li>加入500μL1:1的酚/氯仿的pH值7和反相轻轻，但彻底混合。 </li><li>在13个000克的自旋在室温下约10分钟。 </li><li>删除一个新的管水（顶部）分数。 </li><li>加入十分之一体积的3 M醋酸钠（40μL），拌匀。 </li><li> 100％的乙醇添加2卷（900μL），拌匀，并在-20 ° C为20分钟。 </li><li> 20分钟旋转13 000克在4 ° C。 </li><li>除去乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇。 </li><li>加入500μL70％冷乙醇洗。 20分钟旋转13 000克在4 ° C。 </li><li>取出70％的乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇吹打。 </li><li>空气干燥，在室温为10分钟，以去除残留的乙醇的所有痕迹开放的第沉淀。 </li><li>悬浮的DNA，在50μL灭菌dH2O一夜之间在4 ° C </li><li>使用NanoDrop分光光度计量化的DNA。一个A <sub>260：280</sub>的比例为1.8，是理想的。 </li><li>确定100个基点阶梯琼脂糖凝胶上的DNA的质量和尺寸范围。可低至10纳克的基因组DNA 1.7％琼脂糖凝胶上运行，使用的染料，染色是高度敏感，少量的DNA，如SYBR黄​​金。 </li><li>在每一个样品的硅化管中，准备与该卷的其余部分在总体积50μL，1微克的DNA <sub>与消毒</sub> 生署2 O </li></ol><p class="jove_title"> DNA的超声</p><p class="jove_content"> DNA超声和MeDIP协议必须执行siliconzied管，以防止非特异性结合蛋白管壁。凝胶电泳（27步）确定的DNA样本碎片程度的基础上的DNA样本的最佳超声倍。例如，从培养细胞中提取的DNA应该是非常高的分子量，并随后将需要更多的超声比这往往是部分降解的档案样本中提取DNA。如果样品是均匀的超高分子量，在这一点上，合理进行在本议定书中所描述的没有单独检查每个样品的超声。如果样品零散档案样本，就必须适应超声过程可能通过减少超声次获得300 - 100bp片段。如果您希望处理样品，部分降解，超声参数的优化，可以从利益的代表性样本进行。基于观察到的DNA片段从凝胶电泳（27步）的程度，实验者可以预先确定样品的最佳超声时间。在这里，我们描述了一种方法来获得超声与自动化超声设备使用超高分子量DNA（Bioruptor从Diagenode，UCD - 200 TM）300-1000 bp的DNA片段。 </p><ol><li> Biorupter水必须在4 ° C </li><li>超声用于自动设置的7分钟（30秒30秒在最大功率）。 </li><li>删除超声产品和硅化离心管1.7毫升的免疫反应（IP）的800毫微克（40μL）。 </li><li>抛开其余200纳克（10μL）作为输入（IN）的参考DNA（储存在4 ° C）。 </李&gt; </ol><p class="jove_title"> IMMUNOPRECIPITATON的甲基化的DNA </p><ol><li>变性的，将用于在95℃水浴10分钟IP反应（800纳克）的DNA。 </li><li>酷立即在冰上。让我们的DNA完全冷却（约5分钟冰），然后再继续下一步。 </li><li>新增5微克单克隆抗体。 </li><li>添加IP缓冲液（在室温下使用整个协议）至终体积为500μL。 </li><li>旋转管持有人在2小时在4 ° C孵育。 </li><li>就在第5步完成后，准​​备磁珠洗涤（步骤6-11）。首先，重悬在小瓶珠彻底震荡。 </li><li> 30μL反应加1％的悬浮磁珠（1〜2 × <sup>10</sup> 7）转移到一个新的硅化管（例如，8反应，如果这样做，删除9，即270μL足够珠） 。 </li><li>上放置在室温下2分钟的磁架管。 </li><li>移液器关闭上清。当去除上清，避免接触枪头对内壁珠（珠磁铁吸引）。 </li><li>取出磁铁管，并在IP缓冲区的过剩量（750μL1000μL）重悬珠。回放置在室温下2分钟的磁架管。 </li><li>重复洗一次，然后在第7步中删除原始卷重悬在IP缓冲区的水洗珠。 </li><li>加入30μL洗磁珠每个IP反应</li><li>旋转管持有人在2小时孵育4 ° C。 </li><li>孵化完成后，放在磁架管，在室温下2分钟。 </li><li>移液器关闭上清。枪头，避免接触管内壁（珠磁铁吸引）。加入500μLIP缓冲区。混合管的内容，并把2分钟的磁架。重复用500 UL IP缓冲区一次。 </li><li>删除最后一次洗涤上清液后，重悬在400消化缓冲液珠。 </li><li>治疗蛋白酶K与100微克的反应，并培育一夜之间在50 ° C。 </li></ol><p class="jove_title">免疫沉淀的DNA的分离纯化</p><ol><li>添加500μL1:1的酚/氯仿pH值7和涡彻底。 </li><li>在13个000克的自旋在室温下约10分钟。 </li><li>删除一个新的管水（顶部）分数。 </li><li>重复步骤1到3，如果水相和有机层之间的相间出现浑浊。 </li><li>加入1 / <sup>10</sup>体积3 M醋酸钠（40μL）和涡。 </li><li>新增的糖原（20微克/μL）1μL和旋涡。 </li><li>添加100％的乙醇，涡旋，并在-20 ° C 20分钟2卷（1000μL）。 </li><li> 20分钟旋转13 000克在4 ° C。 </li><li>除去乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇。 </li><li>加入500μL70％冷乙醇洗。涡简单地说，在13个000克的自旋为20分钟，4 ° C。 </li><li>取出70％的乙醇，脉冲旋转，去除残留的乙醇吹打。 </li><li>空气干燥，在室温为10分钟，以去除残留的乙醇的所有痕迹开放的第沉淀。 </li><li>悬浮在10μL的DNA沉淀消毒生<sub>署</sub> 2 0 。 </li></ol><p class="jove_title">通过PCR验证</p><ol><li>您可能会测试，以确保MeDIP程序正在执行MeDIP协议，使用正常的人类DNA（男性或女性），随后化验已知的甲基化丰富的一个区域。 </li><li>删除30％的MeDIP产品，PCR管和其他MeDIP产品的30％到另一个PCR管。 </li><li>将PCR管成10 ng的DNA中，和10纳克到另一个PCR管中的DNA。您现在应该已经设立4个独立的PCR反应。 </li><li>执行PCR扩增H19和CTRL引物如表1所示。 </li><li>准备两个mastermixes（每个引物之一），如表2所列为12.5μL总体积的PCR反应。 </li><li> Thermocycle的PCR用在表3所列的的条件。 </li><li> 5μLPCR产物在2％琼脂糖凝胶的可视化运行。 </li><li>对成功MeDIP的预期结果如表4所示。 </li></ol><p class="jove_title">表</p><p class="jove_content">表1：H19和CTRL引物进行PCR验证。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td>引物</td><td>正向引物</td><td>反向引物</td><td>预期产品尺寸</td></tr><tr><td> H19 </td><td> H19_F 5&#39; - cgagtgtgcgtgagtgtgag </td><td> H19_R 5&#39; - ggcgtaatggaatgcttgaa </td><td> 174 BP </td></tr><tr><td> Ctrl（控制） </td><td> CTRL_F5&#39; - gagagcattagggcagacaaa </td><td> CTRL_R 5&#39; - gttcctcagacagccacattt </td><td> 139 BP </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content">表2。用于PCR反应Mastermixes。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> H19混合（每RXN） </td><td> CTRL键组合（每RXN） </td></tr><tr><tD&gt; DDH <sub>2 O</sub> </td><td> 6.875 </td><td> 6.875 </td></tr><tr><td> 10X缓冲</td><td> 1.25 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> dNTP混合液（10毫米） </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> MgCl <sub>2的</sub> （50毫米） </td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td>引物（H19_F / R或CTRL_F / R）（10微米每个F / R） </td><td> 0.625 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td>白金Taq酶</td><td> 0.25 </td><td> 0.25 </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content">表3。 PCR thermocyling条件。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 95℃ </td><td> 5:00 </td></tr><tr><td rowspan="3"> 40X <br /></td><td> 95℃ </td><td> 0:30 </td></tr><tr><td> 56℃ </td><td> 0:30 </td></tr><tr><td> 72℃ </td><td> 0:15 </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content">表4。预期的成功MeDIP PCR结果。 <br /><br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2" align="center">模板DNA </td></tr><tr><td>底漆使用</td><td>在</td><td>知识产权</td></tr><tr><td> H19 </td><td>积极的</td><td>积极的</td></tr><tr><td>按Ctrl </td><td>积极的</td><td>负面</td></tr></tbody></table></p>

<ol>
	<li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methylome:+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling.">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> <em style='font-style: italic'>Trends Genet</em>. <b>24</b>, 231-237 (2008).</li><li>Lu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics,+disease,+and+therapeutic+interventions.">Epigenetics, disease, and therapeutic interventions.</a> <em style='font-style: italic'>Ageing research reviews</em>. <b>5</b>, 449-467 (2006).</li><li>Zilberman, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+DNA+methylation+patterns.">Genome-wide analysis of DNA methylation patterns.</a> <em style='font-style: italic'>Development</em>. <b>134</b>, 3959-3965 (2007).</li><li>Feinberg, A. 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<p class="jove_content">有一个日益认识到疾病的DNA甲基化起着重要作用，因此发展的分析来衡量这一修改正在成为越来越重要<sup>的3，12，13</sup> 。 MeDIP技术是筛选适合的工具，同时在全基因组位点特异性<sup>的</sup>第<sup>6级</sup> ， 7。这种技术提供了一个快速查看和使用数量有限的起始DNA的DNA甲基化水平，为便于比较不同来源之间允许。使用该MeDIP产品的下游应用领域包括各种芯片的全基因组CpG岛寡核苷酸阵列，直接P...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Biorupter sonicator</td>
<td>Tool</td>
<td>Diagenode</td>
<td>UCD-200 TM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes</td>
<td>Other</td>
<td>Sorenson BioScience</td>
<td>11510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ND 3300 Spectrophotometer</td>
<td>Tool</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Primary Antibody: Anti-5'-methylcytosine mouse mAb</td>
<td>Reagent</td>
<td>CalBiochem</td>
<td>162 33 D3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>112-01D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetic Tube Rack</td>
<td>Tool</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>CS15000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini LabRoller</td>
<td>Tool</td>
<td>Labnet International</td>
<td>H5500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IP Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM NaPO<sub>4</sub> pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100.  Stored at room temperature</td>
</tr>
<tr>
<td>Digestion Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

methylated dna immunoprecipitation

<p class="jove_content">识别DNA甲基化模式是表观遗传学的研究的一个常见的​​程序，作为甲基化是已知的基因表达有显着影响，并与参与的正常发展，以及疾病<sup&gt; 1-4</sup&gt;。因此，能力，区分甲基化的DNA和非甲基化的DNA甲基化谱等研究产生至关重要的。甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）是一个有效的技术甲基化的DNA的提取样本的利益<sup&gt; 5-7</sup&gt;。低至200纳克的DNA样本是足够的抗体或免疫沉淀（IP），反应。 DNA是超声在300-1000 BP大小不等的片段，并划分为免疫沉淀（IP）和输入（IN）部分。 IP DNA随后热变性，然后用反5&#39;mC培养，使单克隆抗体结合甲基化的DNA。在此之后，具有亲和力的抗体二抗磁珠添加，并且孵育。这些珠联抗体结合的单克隆抗体用于第一步。势必抗体复合物（甲基化的DNA）的DNA是分开使用磁铁拉配合物的解决方案，其余的DNA。使用IP缓冲区的几个清洗，然后进行删除未绑定，非甲基化的DNA。甲基化的DNA /抗体复合物，然后用蛋白酶K消化，消化离开只有甲基化的DNA完整的抗体。富集的DNA纯化酚：氯仿抽提去除蛋白质的物质，然后沉淀和再悬浮在水中以备后用。 PCR技术可用于分析知识产权的扩增产物，在已知缺乏的地区，已知含有甲基化序列的DNA，来验证的MeDIP程序的效率。然后可以用于纯化的甲基化的DNA位点特异性（PCR）或全基因组（芯片和测序）甲基化研究，并在结合其他的研究工具，如基因表达谱和阵列比较基因组杂交应用时尤其有用（ CGH）<sup&gt; 8</sup&gt;。到DNA甲基化的进一步调查发现的新的后生目标，这反过来，可能aberrantly甲基化的DNA特征的疾病，如癌症，在发展中国家的新的治疗和预后的研究工具非常有用<sup&gt; 2，4，9-11</sup&gt;。</p>

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Methylated DNA Immunoprecipitation

<p class="jove_content">这个视频演示的甲基化的DNA免疫（MeDIP）协议。 MeDIP是有选择性地从基因组DNA样本中提取5 - 甲基胞嘧啶甲基化的DNA片段具有特异性抗体（抗- 5 MC）为期两天的过程。</p>

甲基化的DNA免疫沉淀

The identification of DNA methylation patterns is a common procedure in the study of epigenetics, as methylation is known to have significant effects on ...

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K 次观看.  BC Cancer Research Centre. 这个视频演示的甲基化的DNA免疫（MeDIP）协议。 MeDIP是有选择性地从基因组DNA样本中提取5 - 甲基胞嘧啶甲基化的DNA片段具有特异性抗体（抗- 5 MC）为期两天的过程。