胃肠癌DNA甲基化基因组全谱分析

因此，利用LA平台对人类基因组中DNA甲基化的复杂畸变进行DNA甲基化全基因组分析，可以提供胃肠道癌表观遗传生物标志物的重要信息。虽然这个LA平台用于人类基因组中DNA甲基化的复杂畸变，但它在成本和基因组覆盖率方面是最佳的。因此，演示这个程序将是Hirotaka莫莫斯，一个研究生从我的实验室。

首先，准备10微米未污染的固定石蜡嵌入部分。将幻灯片放在玻璃滑梯架中，并加满盐水，确保幻灯片上的所有组织都被淹没。将幻灯片留在二甲苯中 15 分钟，然后倒出二甲苯，同时用移液器尖端握住幻灯片，这样它们不会脱落。

将更多的二甲苯倒入与之前相同的水平，并重复孵育。倒出二甲苯，用100%乙醇填充滑轨架，确保滑梯上的所有组织全部浸没。将幻灯片留在乙醇中三分钟，然后用新鲜乙醇代替乙醇，并允许它们再孵育两分钟。

倒掉乙醇并取出幻灯片。小心地把它们放在干净的纸巾上，让它们干燥10分钟。用 80 微升的解液缓冲液填充 1.5 毫升一用聚丙烯管，并在缓冲液中放入干净的移液器尖端。

根据适当的H&E染色部分确定肿瘤区域最适合大切除的肿瘤组织的癌症组织，然后根据标记部分对癌症组织进行宏观切除。拿一把干净的剃刀刀片，轻轻地刮掉幻灯片的癌组织，试图把它留在一块。使用移液器尖端将刮伤的组织转移到解液缓冲瓶中。

对幻灯片的其余部分重复此过程。所有组织都在管中后，使用尖端确保组织完全被淹没，并且不会粘在墙壁上。将20微升的亚蒂林相关丝氨酸蛋白酶添加到小瓶中，轻轻轻拂混合。

将小瓶放在55摄氏度的加热块中至少4小时或过夜，确保两小时后稍微涡流。根据制造商的说明，使用双硫化转化套件对消化组织的 45 微升进行双硫化处理。在样品中加入5微升稀释缓冲液，在37摄氏度下孵育15分钟。

同时，在一管CT转化试剂中加入750微升蒸馏水和210微升稀释缓冲液，准备双硫基转化试剂。通过涡旋混合管10分钟，然后将100微升的制备CT转换试剂添加到每个样品中，然后通过反转混合。在黑暗中在50摄氏度下孵育样品12至16小时。

孵育后，将样品放在冰上10分钟。添加 400 微升的绑定缓冲液，通过上下移液混合每个样品。将每个样品加载到旋转柱中，然后将柱放入两毫升收集管中。

全速离心样品一分钟，然后丢弃流经。将 200 微升的洗涤缓冲液添加到每列中，以全速旋转一分钟，然后丢弃流式处理。在每个列中添加 200 微升脱硫缓冲液，使柱在室温下站立 15 分钟。

孵育后，全速旋转柱一分钟，然后丢弃流经。每次洗涤后，用 200 微升的洗涤缓冲液以全速将柱进行两次清洗。在每个柱子中加入46微升蒸馏水，并将其放在新的无菌1.5毫升一用聚丙烯管中。

旋转管两分钟以脱氧核糖核酸并丢弃柱。DNA现在已准备好进行分析。使用双硫化改性DNA作为定量甲基化特异性PCR的模板，在每个基因分析中评估启动子区域的甲基化。

将文本手稿中描述的试剂组合在一起，并使用 96 井实时 PCR 仪器运行热循环协议。培训组48名胃癌患者的特点如下。患者的平均年龄为74岁，其中男性38岁，女性10岁。

首先，所有48个样本都加载，用于识别异常值。两个样本给出的峰值大于两个标准偏差，这些偏差从其他样本中移出，这些样本被移除。由此产生的热图被分成两组，基于高甲基化和低甲基化。

此热图允许在差分甲基化分析中转录启动位点 1，500 个基对内对前 50 个探头进行可视化。当临床病理因子在多变量分析中用作协变量时，癌症的类型和淋巴结转移的存在成为重要的独立预测因素。最后，发现EPB41L3基因与在微阵列分析中将训练组编成高低甲基化组有强烈关系。

对试验组EPB41L3的微阵列分析结果进行了定量甲基化特异性PCR的验证。在单变量分析中，PGC组织中EPB41L3的RMV明显高于残余胃癌。同样，淋巴结转移样本中的RGV明显高于无淋巴结转移的样本。

因此，根据适当的H&E染色部分，对最适合大手术的癌症组织进行鉴定，才能成功执行此方案。