使用斑马鱼鉴定色素沉着调节因子的反向遗传方法

该协议是各种技术的融合，使研究人员能够描述候选基因在黑色素细胞生物学中的作用。这是实现逻辑推理的整体方法。通过结合各种方法，可以避免混杂因素，并可以帮助研究人员获得实质性的结果。

要开始分析，用0.016%的曲卡因固定48个HPF胚胎。在培养皿中使用几毫升1.5至2%甲基纤维素安装胚胎。用巴斯德移液管挑选胚胎并将它们放入甲基纤维素中以限制成像过程中的运动。

为了获得最佳的横向或背部成像，请以超过 5 倍的放大倍率调整其位置。将培养皿放在显微镜下。使用机械手调整鱼，使所有五个黑色素细胞胚胎条纹同时可见。

使用采集软件捕获图像。如果鱼醒来，将其放入三卡因水中，直到它稳定下来。使用ImageJ软件中的打开工具，打开要量化的图像。

选择手绘形状工具以勾勒出要分析的区域。选择设置测量值选项，单击平均灰度值，然后单击面积。要计算所选区域的平均灰度值，请单击 M 或转到分析并选择测量。

根据感兴趣的阶段，将胚胎转移到含有每毫升0.6毫克Pronase的培养皿中。使用巴斯德移液管，在 5 到 10 分钟后将去皮胚胎转移到含有普通胚胎水的培养皿中。使用玻璃巴斯德移液管，收集约100个胚胎并将其转移到两毫升微量离心管中。

丢弃培养基，加入200微升冰冷的去卵石铃声溶液。将试管放在冰上，用移液管将内容物混合约 20 次以溶解轭。将试管在4摄氏度下以100G离心一分钟两次，然后弃去上清液。

使用一毫升移液管在含有10毫升胰蛋白酶溶液的培养皿中转移脱脂胚胎。使用一毫升移液管混合溶液一次或两次以减少聚集。将胰蛋白酶化的悬浮液通过放置在50毫升锥形管上的70微米过滤器以收集单细胞悬液。

用胰蛋白酶化的悬浮液清洗培养皿以去除表面粘附的细胞。为了使用流式细胞仪计数荧光标记的细胞，在创建新的实验文件夹后，绘制前向散点图与侧向散点图。制作异硫氰酸荧光素强度的直方图。

首先加载野生型单元以设置前向和侧向散射门以及 FITC 阈值。之后，加载从转基因FTYRP GFP系胚胎中分离的细胞以计数黑色素细胞。将胚胎安装在培养皿中的1.5至2%甲基纤维素中。

将其放在显微镜下，并使用移液器吸头将其调整为所需的方向。使用采集软件获取图像。对于小于24 HPF的胚胎，使用10倍放大倍率捕获整个图像，而对于超过24 HPF的胚胎，获取多个扫描场并随后组装它们。

进行测定后，48小时后的明场成像显示存在所有五种色素黑色素团条纹。在48 HPF阶段，计算了侧黑色素载体的数量，发现组蛋白变体h2afv形态体与对照相比表现出更少的黑色素载体数量。测量CA14和h2afv形态体的平均灰度值，表明变异体的平均灰度值高于对照形态体。

通过采用基于氢氧化钠的分光光度吸收方法，定量了黑色素含量，其中CA14形态的含量低于对照形态。进行荧光成像以评估斑马鱼黑素细胞发育不同阶段的基于吗啉基的改变。使用FACS分析CA14和h2afv形态体中的黑色素团数量。

观察到CA14中的黑色素团数量保持不变，而与对照形态相比，h2afv中的黑色素团数量显着减少。还计算了单位面积的平均荧光强度，表明h2afv形态体相对于对照形态体的值显着降低。在成像前调整鱼时，请确保您可以可视化所有五个黑色素细胞条纹。

您需要稍微倾斜鱼以区分两条侧条纹。在确定候选基因在黑色素细胞发育中的作用后，我们可以使用CRISPR技术以组织特异性的方式消除该基因。这将是一个更有针对性的方法。