هذا البروتوكول هو دمج التقنيات المختلفة التي من شأنها أن تمكن الباحثين من تحديد دور الجين المرشح في بيولوجيا الخلايا الصباغية. إنه نهج شامل نحو تحقيق الاستدلال المنطقي. من خلال الجمع بين الأساليب المختلفة ، يمكن تجنب العوامل المربكة ويمكن أن تساعد الباحثين في الحصول على نتيجة جوهرية.
لبدء التحليل ، شل حركة أجنة HPF 48 بنسبة 0.016٪ تريكايين. قم بتركيب الأجنة باستخدام بضعة ملليلتر من 1.5 إلى 2٪ ميثيل السليلوز في طبق بتري. اختر الأجنة باستخدام ماصة باستور وضعها في ميثيل السليلوز لتقييد الحركة أثناء التصوير.
للحصول على أفضل تصوير جانبي أو ظهري ، اضبط موضعها بتكبير يزيد عن 5X. ضع طبق بتري تحت المجهر. باستخدام مناور ، اضبط السمكة بحيث تكون جميع الخطوط الجنينية الخمسة للخلايا الصباغية مرئية في وقت واحد.
باستخدام برنامج الاستحواذ ، التقط الصور. إذا استيقظت السمكة ، ضعها في ماء التريكايين حتى تستقر. باستخدام الأداة المفتوحة في برنامج ImageJ ، افتح الصورة المراد قياسها كميا.
حدد أداة الشكل الحر لتخطيط المساحة المراد تحليلها. حدد خيار تعيين القياسات ، وانقر فوق متوسط القيمة الرمادية ثم المنطقة. لحساب متوسط القيمة الرمادية للمنطقة المحددة ، انقر فوق M أو انتقل للتحليل وحدد القياس.
بناء على مرحلة الاهتمام ، انقل الأجنة إلى طبق بتري يحتوي على 0.6 ملليغرام لكل ملليلتر بروناز. باستخدام ماصة باستور ، انقل الأجنة المنزوعة الأيونات إلى طبق بتري يحتوي على ماء جنين عادي بعد خمس إلى 10 دقائق. باستخدام ماصة باستور الزجاجية ، قم بجمع ونقل حوالي 100 جنين إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر.
تخلص من الوسط وأضف 200 ميكرولتر من محلول deyolking Ringers البارد المثلج. ضع الأنبوب على الثلج واخلط المحتوى حوالي 20 مرة باستخدام ماصة لإذابة النير. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب عند 100 جرام لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية مرتين ، وتخلص من المادة الطافية.
نقل الأجنة منزوعة الصفار باستخدام ماصة ملليلتر واحد في طبق بتري يحتوي على 10 ملليلتر من محلول التربسين. امزج المحلول مرة أو مرتين باستخدام ماصة ملليلتر واحد لتقليل التجميع. مرر معلق التربسين من خلال مصفاة 70 ميكرومتر موضوعة على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لجمع تعليق خلية واحدة.
اغسل أطباق بتري بتعليق التربسين لإزالة الخلايا الملتصقة من السطح. لحساب الخلايا ذات العلامات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، بعد إنشاء مجلد تجربة جديد ، ارسم مخططا مبعثرا للأمام مقابل الجانب. جعل الرسم البياني لشدة الفلوريسئين إيزوثيوسيانات.
قم بتحميل خلايا النوع البري أولا لتعيين بوابات التشتت الأمامية والجانبية وعتبة FITC. بعد ذلك ، قم بتحميل الخلايا المعزولة من أجنة خط FTYRP GFP المعدلة وراثيا لحساب الخلايا الصباغية. قم بتركيب الأجنة في 1.5 إلى 2٪ ميثيل السليلوز في طبق بتري.
ضعه تحت المجهر واضبطه في الاتجاه المطلوب باستخدام طرف ماصة. باستخدام برنامج الاستحواذ ، احصل على الصور. بالنسبة للأجنة التي تقل عن 24 HPF ، باستخدام تكبير 10X ، التقط الصورة بأكملها ، بينما بالنسبة للأجنة التي تزيد عن 24 HPF ، احصل على حقول مسح متعددة وقم بتجميعها لاحقا.
بعد إجراء الفحص ، كشف تصوير برايتفيلد بعد 48 ساعة عن وجود جميع خطوط الميلانوفور الخمسة المصطبغة. في مرحلة 48 HPF ، تم حساب عدد الميلانوفورات الجانبية ووجد أن مورفانت h2afv متغير هيستون أظهر عددا أقل من الميلانوفورات مقارنة بالسيطرة. تم قياس متوسط القيمة الرمادية لمورفانت CA14 و h2afv ، والتي كشفت أن القيم كانت أعلى للمتغيرات من مورفانت التحكم.
من خلال استخدام طريقة الامتصاص الطيفي القائم على هيدروكسيد الصوديوم ، تم تحديد محتوى الميلانين حيث أظهرت مورفانات CA14 محتوى أقل من مورفانت التحكم. تم إجراء التصوير الفلوري لتقييم التغيير القائم على المورفولينو لمراحل مختلفة من تطور ميلانوفور الزرد. تم تحليل عدد الميلانوفورات في مورفانتس CA14 و h2afv باستخدام FACS.
وقد لوحظ أن عدد الميلانوفورات في CA14 لم يتغير ، في حين أنها انخفضت بشكل كبير في h2afv مقارنة بمورفانت السيطرة. كما تم حساب متوسط شدة التألق لكل منطقة ، مما يدل على أن مورفانتس h2afv تظهر انخفاضا كبيرا في القيمة بالنسبة إلى مورفانت التحكم. أثناء ضبط السمكة قبل التصوير ، تأكد من أنه يمكنك تصور جميع خطوط الميلانوفور الخمسة.
تحتاج إلى إمالة السمكة قليلا للتمييز بين الخطين الجانبيين. بعد تحديد دور الجين المرشح في تطور الخلايا الصباغية ، يمكننا القضاء على الجين بطريقة خاصة بالأنسجة باستخدام تقنية كريسبر. وسيكون ذلك نهجا أكثر استهدافا.
