このプロトコルは、研究者がメラノサイト生物学における候補遺伝子の役割を描写することを可能にするさまざまな技術の融合です。これは、論理的な推論を達成するための全体的なアプローチです。さまざまな方法を組み合わせることで、交絡因子を回避でき、研究者が実質的な結果を得るのに役立ちます。
分析を開始するには、48個のHPF胚を0.016%トリカインで固定化します。ペトリ皿に数ミリリットルの1.5〜2%メチルセルロースを使用して胚をマウントします。パスツールピペットで胚をピックし、メチルセルロースに入れてイメージング中の動きを制限します。
最適な横方向または背側のイメージングのために、5倍以上の倍率でそれらの位置を調整します。ペトリ皿を顕微鏡下に置きます。マニピュレーターを使用して、5つのメラノサイト胚の縞模様すべてが同時に見えるように魚を調整します。
取得ソフトウェアを使用して、画像をキャプチャします。魚が目覚めたら、安定するまでトリカイン水に入れます。ImageJソフトウェアのオープンツールを使用して、定量化する画像を開きます。
フリーハンド形状ツールを選択して、解析する領域の輪郭を描きます。測定の設定オプションを選択し、平均グレー値をクリックしてから領域をクリックします。選択した領域の平均グレー値を計算するには、Mをクリックするか、分析に移動してメジャーを選択します。
関心のある段階に基づいて、胚をミリリットル当たり0.6ミリグラムのプロナーゼを含むペトリ皿に移す。パスツールピペットを使用して、5〜10分後に脱絨毛胚をプレーン胚水を含むペトリ皿に移します。ガラス製のパスツールピペットで、約100個の胚を収集し、2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
培地を廃棄し、200マイクロリットルの氷冷脱ヨウ素リンガー溶液を加えます。チューブを氷の上に置き、内容物をピペットで約20回混合してヨークを溶かします。チューブを100Gで1分間、摂氏4度で2回遠心分離し、上清を廃棄します。
10ミリリットルのトリプシン溶液を含むペトリ皿に1ミリリットルのピペットを使用して脱卵胚を移します。凝集を減らすために1ミリリットルのピペットを使用して溶液を1〜2回混合します。トリプシン処理された懸濁液を、50ミリリットルの円錐形チューブ上に置かれた70マイクロメートルのストレーナーに通し、単一細胞懸濁液を採取します。
トリプシン処理懸濁液でペトリ皿を洗浄し、付着した細胞を表面から除去する。フローサイトメーターを用いて蛍光標識した細胞を計数するために、新しい実験フォルダを作成した後、前方対側方散布図を描く。フルオレセインイソチオシアネートの強度のヒストグラムを作成します。
最初にワイルドタイプのセルをロードして、前方および側面スキャッターゲートとFITCしきい値を設定します。その後、トランスジェニックFTYRP GFP株胚から単離した細胞をロードし、メラノサイトをカウントする。ペトリ皿の1.5〜2%メチルセルロースに胚をマウントします。
顕微鏡下に置き、ピペットチップを使用して希望の方向に調整します。取得ソフトウェアを使用して、画像を取得します。24 HPF未満の胚の場合は、10倍の倍率を使用して画像全体をキャプチャし、24 HPFを超える胚の場合は、複数のスキャンフィールドを取得して組み立てます。
アッセイを行った後、48時間後の明視野イメージングにより、5つの色素性メラノフォアストライプすべての存在が明らかになりました。48 HPF段階で、外側メラノフォアの数を計算し、ヒストン変異体h2afvモルファントは、対照と比較してメラノフォアの数が減少していることがわかりました。CA14およびh2afvモルファントの平均グレイ値を測定したところ、対照モルファントよりもバリアントの値が高いことが明らかになりました。
水酸化ナトリウムベースの分光光度吸収法を採用することにより、CA14モルファントがコントロールモルファントよりも少ない含有量を示したメラニン含有量を定量しました。ゼブラフィッシュメラノフォアの発達のさまざまな段階のモルホリノベースの変化を評価するために蛍光イメージングを実施しました。CA14およびh2afvモルファント中のメラノフォアの数をFACSを用いて分析した。
CA14のメラノフォアの数は変化しないが、h2afvでは対照モルファントと比較して有意に減少していることが観察された。面積当たりの平均蛍光強度も計算され、h2afvモルファントは対照モルファントと比較して値のかなりの減少を示すことが示された。イメージングの前に魚を調整するときは、5つのメラノフォアストライプすべてを視覚化できることを確認してください。
2本の横縞を区別するために魚を少し傾ける必要があります。メラノサイト発生における候補遺伝子の役割を確立した後、CRISPR技術を使用して組織特異的な方法で遺伝子を排除することができます。それはより的を絞ったアプローチになります。
