Bu protokol, araştırmacıların melanosit biyolojisinde aday genin rolünü tanımlamalarını sağlayacak çeşitli tekniklerin bir birleşimidir. Mantıksal bir çıkarım elde etmeye yönelik bütüncül bir yaklaşımdır. Çeşitli yöntemleri birleştirerek, kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınılabilir ve araştırmacıların önemli bir sonuç elde etmelerine yardımcı olabilir.
Analize başlamak için, 48 HPF embriyosunu% 0.016 trikain ile hareketsiz hale getirin. Embriyoları bir Petri kabında birkaç mililitre% 1.5 ila% 2 metil selüloz kullanarak monte edin. Embriyoları bir Pasteur pipeti ile seçin ve görüntüleme sırasında hareketi kısıtlamak için metil selüloza yerleştirin.
Optimum lateral veya dorsal görüntüleme için, konumlarını 5X'ten fazla büyütme ile ayarlayın. Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir manipülatör kullanarak, balıkları beş melanosit embriyonik çizginin tümü aynı anda görülecek şekilde ayarlayın.
Edinme yazılımını kullanarak görüntüleri yakalayın. Balık uyanırsa, stabilize olana kadar trikain suyuna koyun. ImageJ yazılımındaki açık aracı kullanarak, ölçülecek görüntüyü açın.
Analiz edilecek alanın ana hatlarını çizmek için serbest şekil aracını seçin. Ölçümleri ayarla seçeneğini belirleyin, ortalama gri değere ve ardından alana tıklayın. Seçilen alanın ortalama gri değerini hesaplamak için M'ye tıklayın veya analiz edip ölçüyü seçin.
İlgilenilen aşamaya bağlı olarak, embriyoları mililitre Pronaz başına 0.6 miligram içeren bir Petri kabına aktarın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, dekoryonlanmış embriyoları beş ila 10 dakika sonra düz embriyo suyu içeren bir Petri kabına aktarın. Bir cam Pasteur pipet ile yaklaşık 100 embriyo toplayın ve iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Ortamı atın ve 200 mikrolitre buz gibi soğuk deyolking Ringers çözeltisi ekleyin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve boyunduruğu çözmek için içeriği bir pipetle yaklaşık 20 kez karıştırın. Tüpleri 100 G'de bir dakika boyunca dört santigrat derecede iki kez santrifüj edin ve süpernatanı atın.
Yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları, 10 mililitre tripsin çözeltisi içeren bir Petri kabında bir mililitrelik bir pipet kullanarak aktarın. Toplamayı azaltmak için bir mililitrelik pipet kullanarak çözeltiyi bir veya iki kez karıştırın. Tek bir hücre süspansiyonu toplamak için tripnize edilmiş süspansiyonu 50 mililitrelik bir konik tüp üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirin.
Yapışmış hücreleri yüzeyden çıkarmak için Petri bulaşıklarını tripsinized süspansiyonla yıkayın. Bir akış sitometresi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücreleri saymak için, yeni bir deney klasörü oluşturduktan sonra, ileri ve yan saçılma grafiği çizin. Floresein izotiyosiyanatın yoğunluğu için bir histogram yapın.
İleri ve yan saçılma kapılarını ve FITC eşiğini ayarlamak için önce vahşi tip hücreleri yükleyin. Daha sonra, melanositleri saymak için transgenik FTYRP GFP hattı embriyolarından izole edilen hücreleri yükleyin. Embriyoları bir petri kabında% 1.5 ila% 2 metil selüloza monte edin.
Mikroskop altına yerleştirin ve bir pipet ucu kullanarak istediğiniz yönde ayarlayın. Satın alma yazılımını kullanarak görüntüleri edinin. 24 HPF'den küçük embriyolar için, 10X büyütme kullanarak, tüm görüntüyü yakalayın, 24 HPF'den fazla embriyolar için ise birden fazla tarama alanı elde edin ve daha sonra bunları birleştirin.
Tahlil yapıldıktan sonra, 48 saat sonra Brightfield görüntülemesi, beş pigmentli melanofor çizgisinin hepsinin varlığını ortaya çıkardı. 48 HPF evresinde, lateral melanofor sayısı hesaplandı ve histon varyantı h2afv morfantlarının kontrole kıyasla melanofor sayısında azalma gösterdiği bulundu. Ortalama gri değer CA14 ve h2afv morfantları için ölçüldü, bu da varyantlar için değerlerin kontrol morfantlarından daha yüksek olduğunu ortaya koydu.
Sodyum hidroksit bazlı spektrofotometrik absorpsiyon yöntemi kullanılarak, CA14 morfantlarının kontrol morfantlarından daha az içerik gösterdiği melanin içeriği ölçüldü. Zebra balığı melanofor gelişiminin farklı aşamalarında morfolino bazlı değişiklikleri değerlendirmek için floresan görüntüleme yapıldı. CA14 ve h2afv morfantlarındaki melanofor sayısı FACS kullanılarak analiz edildi.
CA14'teki melanofor sayısının değişmeden kaldığı, h2afv'de ise kontrol morfantına kıyasla anlamlı derecede azaldığı gözlendi. Alan başına ortalama floresan yoğunluğu da hesaplandı ve h2afv morfantlarının kontrol morfantlarına göre değerde önemli bir düşüş gösterdiği gösterildi. Görüntülemeden önce balıkları ayarlarken, beş melanofor çizgisini de görselleştirebildiğinizden emin olun.
İki yanal çizgiyi ayırt etmek için balıkları biraz eğmeniz gerekir. Melanosit gelişiminde aday genin rolünü belirledikten sonra, CRISPR teknolojisini kullanarak geni dokuya özgü bir şekilde ortadan kaldırabiliriz. Bu daha hedefli bir yaklaşım olacaktır.
