이 프로토콜은 연구자들이 멜라닌 세포 생물학에서 후보 유전자의 역할을 설명할 수 있도록 하는 다양한 기술의 융합입니다. 논리적 추론을 달성하기 위한 전체론적 접근 방식입니다. 다양한 방법을 결합함으로써 교란 요인을 피할 수 있으며 연구자가 실질적인 결과를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
분석을 시작하려면 48개의 HPF 배아를 0.016% 트리카인으로 고정합니다. 페트리 접시에 1.5-2 % 메틸 셀룰로오스 몇 밀리리터를 사용하여 배아를 장착하십시오. 파스퇴르 피펫으로 배아를 선택하고 메틸 셀룰로오스에 넣어 이미징 중 움직임을 제한합니다.
최적의 측면 또는 등쪽 이미징을 위해 5X 이상의 배율로 위치를 조정하십시오. 페트리 접시를 현미경으로 놓습니다. 매니퓰레이터를 사용하여 5 개의 멜라닌 세포 배아 줄무늬가 동시에 보이도록 물고기를 조정하십시오.
획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처합니다. 물고기가 깨어 나면 안정 될 때까지 트리카인 물에 넣으십시오. ImageJ 소프트웨어의 열기 도구를 사용하여 정량화할 이미지를 엽니다.
자유형 도구를 선택하여 분석할 영역의 윤곽선을 그립니다. 측정값 설정 옵션을 선택하고 평균 회색 값을 클릭한 다음 영역을 클릭합니다. 선택한 영역의 평균 회색 값을 계산하려면 M을 클릭하거나 분석으로 이동하여 측정을 선택합니다.
관심있는 단계에 따라 배아를 밀리리터 당 0.6 밀리그램의 Pronase가 들어있는 페트리 접시로 옮깁니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 5-10분 후에 탈모막된 배아를 일반 배아 물이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 약 100개의 배아를 수집하여 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브에 옮깁니다.
배지를 버리고 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 탈노킹 링거 용액을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 내용물을 피펫으로 약 20회 혼합하여 요크를 녹입니다. 튜브를 섭씨 4도에서 1분 동안 100G에서 두 번 원심분리하고 상층액을 버립니다.
10 밀리리터의 트립신 용액이 들어있는 페트리 접시에 1 밀리리터 피펫을 사용하여 탈노른자 배아를 옮깁니다. 응집을 줄이기 위해 1 밀리리터 피펫을 사용하여 용액을 한두 번 혼합하십시오. 트립신 처리된 현탁액을 50밀리리터 원뿔형 튜브에 놓인 70마이크로미터 스트레이너를 통해 통과시켜 단일 세포 현탁액을 수집합니다.
트립신 처리된 현탁액으로 페트리 접시를 세척하여 표면에서 부착된 세포를 제거합니다. 유세포 분석기를 사용하여 형광 표지된 세포의 수를 계산하려면 새 실험 폴더를 만든 후 전방 대 측면 산점도를 그립니다. fluorescein isothiocyanate의 강도에 대한 히스토그램을 만듭니다.
먼저 야생형 셀을 로드하여 순방향 및 측면 산란 게이트와 FITC 임계값을 설정합니다. 그 후, 형질전환 FTYRP GFP 라인 배아에서 분리된 세포를 로딩하여 멜라닌 세포를 계수합니다. 페트리 접시에 1.5-2 % 메틸 셀룰로오스에 배아를 장착하십시오.
현미경 아래에 놓고 피펫 팁을 사용하여 원하는 방향으로 조정합니다. 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득합니다. 24 HPF 미만의 배아의 경우 10X 배율을 사용하여 전체 이미지를 캡처하는 반면, 24 HPF 이상의 배아의 경우 여러 스캔 필드를 획득하여 조립합니다.
분석을 수행한 후 48시간 후 명시야 이미징을 통해 5개의 색소 멜라노포어 줄무늬가 모두 존재함을 알 수 있었습니다. 48 HPF 단계에서, 측면 멜라노포어의 수를 계산하였고, 히스톤 변이체 h2afv 모펀트가 대조군에 비해 감소된 수의 멜라노포어를 입증한 것으로 밝혀졌다. 평균 회색 값은 CA14 및 h2afv 모펀트에 대해 측정되었으며, 이는 값이 대조군 모펀트보다 변이체에 대해 더 높다는 것을 보여주었습니다.
수산화나트륨 기반 분광광도계 흡수법을 사용하여 멜라닌 함량을 정량화하여 CA14 모르펀트가 대조군 모르펀트보다 적은 함량을 보였습니다. 제브라피쉬 멜라노포어 발달의 여러 단계에 대한 모르폴리노 기반 변경을 평가하기 위해 형광 이미징을 수행했습니다. CA14 및 h2afv 모펀트의 멜라노포어의 수는 FACS를 사용하여 분석되었습니다.
CA14의 멜라노포어 수는 변하지 않은 채로 유지된 반면, 대조군 모르펀트에 비해 h2afv에서는 유의하게 감소한 것으로 관찰되었습니다. 면적당 평균 형광 강도도 계산되어 h2afv 모펀트가 대조군 모펀트에 비해 값이 상당히 감소함을 보여줍니다. 이미징하기 전에 물고기를 조정하는 동안 5개의 멜라노포어 줄무늬를 모두 시각화할 수 있는지 확인하십시오.
두 개의 측면 줄무늬를 구별하기 위해 물고기를 약간 기울여야합니다. 멜라닌 세포 발달에서 후보 유전자의 역할을 확립한 후 CRISPR 기술을 사용하여 조직 특이적 방식으로 유전자를 제거할 수 있습니다. 그것은 더 표적화 된 접근 방식이 될 것입니다.
