Ce protocole est un amalgame de diverses techniques qui permettraient aux chercheurs de délimiter le rôle du gène candidat dans la biologie des mélanocytes. Il s’agit d’une approche holistique pour parvenir à une inférence logique. En combinant diverses méthodes, les facteurs de confusion peuvent être évités et cela peut aider les chercheurs à obtenir un résultat substantiel.
Pour commencer l’analyse, immobiliser les 48 embryons HPF avec 0,016% de tricaïne. Montez les embryons en utilisant quelques millilitres de 1,5 à 2% de méthylcellulose dans une boîte de Pétri. Prélevez les embryons avec une pipette Pasteur et placez-les dans de la méthylcellulose pour restreindre les mouvements pendant l’imagerie.
Pour une imagerie latérale ou dorsale optimale, ajustez leur position avec un grossissement de plus de 5X. Placez la boîte de Petri sous le microscope. À l’aide d’un manipulateur, ajustez le poisson de manière à ce que les cinq bandes embryonnaires mélanocytaires soient visibles simultanément.
À l’aide du logiciel d’acquisition, capturez les images. Si le poisson se réveille, placez-le dans de l’eau tricaïne jusqu’à ce qu’il se stabilise. À l’aide de l’outil d’ouverture du logiciel ImageJ, ouvrez l’image à quantifier.
Sélectionnez l’outil de forme à main levée pour délimiter la zone à analyser. Sélectionnez l’option Définir les mesures, cliquez sur la valeur de gris moyenne, puis sur la zone. Pour calculer la valeur de gris moyenne pour la zone sélectionnée, cliquez sur M ou allez à analyser et sélectionnez mesurer.
En fonction du stade d’intérêt, transférer les embryons dans une boîte de Petri contenant 0,6 milligramme par millilitre de Pronase. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer les embryons déchorionnés dans une boîte de Petri contenant de l’eau embryonnaire ordinaire après cinq à 10 minutes. Avec une pipette Pasteur en verre, prélever et transférer environ 100 embryons dans un tube microcentrifuge de deux millilitres.
Jeter le milieu et ajouter 200 microlitres de solution glacée de Ringers d’éjoliveur. Placez le tube sur de la glace et mélangez le contenu environ 20 fois avec une pipette pour dissoudre le joug. Centrifuger les tubes à 100 G pendant une minute à quatre degrés Celsius deux fois et jeter le surnageant.
Transférer les embryons éblifiés à l’aide d’une pipette d’un millilitre dans une boîte de Petri contenant 10 millilitres de solution de trypsine. Mélanger la solution une ou deux fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre pour diminuer l’agrégation. Passez la suspension trypsinisée à travers une passoire de 70 micromètres placée sur un tube conique de 50 millilitres pour recueillir une suspension unicellulaire.
Lavez les boîtes de Petri avec la suspension trypsinisée pour éliminer les cellules collées de la surface. Pour compter les cellules marquées par fluorescence à l’aide d’un cytomètre en flux, après avoir créé un nouveau dossier d’expérience, dessinez un diagramme de dispersion avant ou latéral. Faites un histogramme pour l’intensité de l’isothiocyanate de fluorescéine.
Chargez d’abord les cellules de type wild pour définir les portes de diffusion avant et latérale et le seuil FITC. Ensuite, chargez les cellules isolées des embryons transgéniques de la lignée FTYRP GFP pour compter les mélanocytes. Monter les embryons dans 1,5 à 2% de méthylcellulose dans une boîte de Pétri.
Placez-le sous le microscope et ajustez-le dans l’orientation souhaitée à l’aide d’une pointe de pipette. À l’aide du logiciel d’acquisition, acquérir les images. Pour les embryons de moins de 24 HPF, en utilisant un grossissement de 10X, capturez l’image entière, tandis que pour les embryons de plus de 24 HPF, acquérez plusieurs champs de balayage et les assemblez ensuite.
Après avoir effectué le test, l’imagerie en fond clair après 48 heures a révélé la présence des cinq bandes mélanophores pigmentées. Au stade 48 HPF, le nombre de mélanophores latéraux a été calculé et il a été constaté que les morphants h2afv de la variante histones présentaient un nombre réduit de mélanophores par rapport au témoin. La valeur moyenne de gris a été mesurée pour les morphants CA14 et h2afv, ce qui a révélé que les valeurs étaient plus élevées pour les variants que pour les morphants témoins.
En utilisant une méthode d’absorption spectrophotométrique à base d’hydroxyde de sodium, la teneur en mélanine a été quantifiée lorsque les morphants CA14 présentaient une teneur inférieure à celle des morphants témoins. L’imagerie par fluorescence a été réalisée pour évaluer l’altération à base de morpholino à différents stades du développement du mélanophore du poisson zèbre. Le nombre de mélanophores dans les morphants CA14 et h2afv a été analysé à l’aide de FACS.
Il a été observé que le nombre de mélanophores dans CA14 est resté inchangé, alors qu’ils ont été significativement réduits dans h2afv par rapport au morphant témoin. L’intensité moyenne de fluorescence par zone a également été calculée, démontrant que les morphants h2afv montrent une diminution considérable de la valeur par rapport aux morphants témoins. Tout en ajustant le poisson avant l’imagerie, assurez-vous de pouvoir visualiser les cinq bandes mélanophores .
Vous devez incliner un peu le poisson pour distinguer les deux bandes latérales. Après avoir établi le rôle d’un gène candidat dans le développement des mélanocytes, nous pouvons éliminer le gène d’une manière spécifique au tissu en utilisant la technologie CRISPR. Il s’agira d’une approche plus ciblée.
