Este protocolo é uma amálgama de várias técnicas que permitiriam aos pesquisadores delinear o papel do gene candidato na biologia dos melanócitos. É uma abordagem holística para alcançar uma inferência lógica. Ao combinar vários métodos, fatores de confusão podem ser evitados e podem ajudar os pesquisadores a obter um resultado substancial.
Para iniciar a análise, imobilizar os 48 embriões de HPF com 0,016% de tricaína. Monte os embriões usando alguns mililitros de 1,5 a 2% de metilcelulose em uma placa de Petri. Pegue os embriões com uma pipeta de Pasteur e coloque-os em metilcelulose para restringir o movimento durante a imagem.
Para obter imagens laterais ou dorsais ideais, ajuste sua posição com uma ampliação de mais de 5X. Coloque a placa de Petri sob o microscópio. Usando um manipulador, ajuste o peixe para que todas as cinco listras embrionárias de melanócitos sejam visíveis simultaneamente.
Usando o software de aquisição, capture as imagens. Se o peixe despertar, coloque-o em água de tricaína até estabilizar. Usando a ferramenta aberta no software ImageJ, abra a imagem a ser quantificada.
Selecione a ferramenta de forma à mão livre para delinear a área a ser analisada. Selecione a opção definir medidas, clique no valor cinza médio e, em seguida, na área. Para calcular o valor médio de cinza para a área selecionada, clique em M ou vá para analisar e selecionar a medida.
Com base no estágio de interesse, transferir os embriões para uma placa de Petri contendo 0,6 miligramas por mililitro de Pronase. Usando uma pipeta de Pasteur, transfira os embriões descorionados para uma placa de Petri contendo água pura do embrião após cinco a 10 minutos. Com uma pipeta de vidro Pasteur, colete e transfira cerca de 100 embriões para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Descarte o meio e adicione 200 microlitros de solução gelada de Deyolking Ringers. Coloque o tubo sobre gelo e misture o conteúdo cerca de 20 vezes com uma pipeta para dissolver o jugo. Centrifugar os tubos a 100 G por um minuto a quatro graus Celsius duas vezes e descartar o sobrenadante.
Transfira os embriões desgemados usando uma pipeta de um mililitro em uma placa de Petri contendo 10 mililitros de solução de tripsina. Misture a solução uma ou duas vezes usando uma pipeta de um mililitro para diminuir a agregação. Passe a suspensão tripsinizada através de um filtro de 70 micrômetros colocado em um tubo cônico de 50 mililitros para coletar uma suspensão de célula única.
Lave as placas de Petri com a suspensão tripsinizada para remover as células aderidas da superfície. Para contar as células fluorescentemente marcadas usando um citômetro de fluxo, depois de criar uma nova pasta de experimento, desenhe um gráfico de dispersão para frente versus lateral. Faça um histograma para a intensidade do isotiocianato de fluoresceína.
Carregue as células do tipo selvagem primeiro para definir as portas de dispersão frontal e lateral e o limite FITC. Em seguida, carregar as células isoladas de embriões transgênicos da linhagem FTYRP GFP para contar os melanócitos. Montar os embriões em 1,5 a 2% de metilcelulose em uma placa de Petri.
Coloque-o sob o microscópio e ajuste-o na orientação desejada usando uma ponta de pipeta. Utilizando o software de aquisição, adquira as imagens. Para embriões com menos de 24 HPF, usando ampliação de 10X, capturar a imagem inteira, enquanto para embriões com mais de 24 HPF, adquirir vários campos de varredura e posteriormente montá-los.
Após a realização do ensaio, a imagem de Brightfield após 48 horas revelou a presença de todas as cinco listras de melanóforos pigmentados. No estágio de 48 CGA, o número de melanóforos laterais foi calculado e verificou-se que os morfos da variante histona h2afv demonstraram um número reduzido de melanóforos em relação ao controle. O valor médio de cinza foi medido para os morfantes CA14 e h2afv, o que revelou que os valores foram maiores para as variantes do que para os morfantes controle.
Empregando um método espectrofotométrico de absorção baseado em hidróxido de sódio, o conteúdo de melanina foi quantificado onde os morfantes CA14 apresentaram menor conteúdo do que os morfantes controle. Imagens de fluorescência foram realizadas para avaliar a alteração morfolínica para diferentes estágios de desenvolvimento do melanóforo do peixe-zebra. O número de melanóforos nos morfos CA14 e h2afv foi analisado usando FACS.
Observou-se que o número de melanóforos no CA14 permaneceu inalterado, enquanto eles foram significativamente reduzidos no h2afv em comparação com o morfo controle. A intensidade média de fluorescência por área também foi calculada, demonstrando que os morfontes h2afv apresentam uma diminuição considerável no valor em relação aos morfantes controle. Ao ajustar os peixes antes de fazer a imagem, certifique-se de que você possa visualizar todas as cinco listras de melanóforo.
Você precisa inclinar um pouco o peixe para distinguir entre as duas listras laterais. Depois de estabelecer o papel de um gene candidato no desenvolvimento de melanócitos, podemos eliminar o gene de forma tecido-específica usando a tecnologia CRISPR. Essa será uma abordagem mais direcionada.
