通过元条形码分析监测智利有害藻华的标准化程序

该协议提供了对藻华以及如何有效监测有毒藻类物种的见解。该程序有助于提供藻华的早期预警，以保护社区免受相关损害。元条形码分析可以同时检测样品中的许多物种，但它需要复杂的程序。

该协议直观地解释了每个步骤，以帮助最大限度地减少分析过程中的人为错误。显微镜程序将由安托法加斯塔大学的Henry Cameron演示，由Instituto de Fomento Pesquero的Jonathan Vilugron收集样本，由Los Lagos大学的Karen Vergara进行样品预处理，以及来自La Frontera大学的Ignacio Rilling和Marco Campos的元条形码分析。首先从目标点收集三升水样。

过滤一升水，通过串联过滤进行16S rRNA分析，以分离自由活体和附着的细菌。接下来，通过0.2微米膜的单次过滤过滤另一升水以进行18S rRNA分析。然后，使用无菌手术剪刀，将过滤后的膜切成两半，用铝箔包裹一半进行储存，另一半用Chelex方法进行DNA提取。

对于显微镜分析，使用移液器将一毫升水样转移到一毫升网格载玻片上。在显微镜下观察样品并记录浮游植物物种的名称和数量。在层流罩柜中用70%乙醇清洁移液器，然后紫外线照射30分钟。

对于第一次PCR扩增子生成，在八管条中等分22.5微升预混液，然后用2.5微升DNA样品，然后运行第一个PCR循环。接下来，制备100毫升含有10微升核酸凝胶染色剂的2%琼脂糖TBE凝胶。凝胶准备就绪后，上样含有1.5微升DNA上样染料和4微升PCR产物的混合物，并在100伏特下进行电泳30分钟。

然后，在紫外光下对凝胶进行成像，并确认存在500至600碱基对条带。缺失的扩增子有时可以通过用水稀释至1， 000倍来解决。接下来，使用基于磁珠的DNA纯化系统清洁第一个PCR产物，然后将每个清洁的第一个PCR产物的20微升转移到新的96孔板中，并用微封膜密封该板。

将盘子存放在零下20摄氏度，直到下一步。对于第二次PCR的分度，在用PCR级水在八管PCR条中稀释所有索引1和索引两个引物至1微摩尔浓度后，将索引1引物置于水平行中，并将两个引物索引在垂直行中。然后，使用多通道移液器在2.5微升的指数下将一个引物插入到新的96孔板的每个孔中。

接下来，向每个孔中加入12.5微升热启动制剂。然后，向每个孔中加入2.5微升指数2引物和7.5微升纯化的第一PCR产物。通过上下移液10次混合后，用微密封膜盖住板并运行第二个PCR循环。

PCR完成后，将DNA筛网胶带放入片段分析仪中。将两微升样品缓冲液与三微升的第二个PCR扩增子混合到新的八管条中，并将试纸插入片段分析仪以开始分析。确保第二个PCR扩增子对于16S和18S rRNA基因都是大约613个碱基对。

如前所述，使用磁珠DNA纯化系统纯化第二个PCR产物。然后使用核酸定量分光光度计测量其DNA浓度。在新的200微升96孔板中，用无菌PCR水将每个纯化的第二PCR产物稀释至4纳摩尔。

下一步，协议必须在不停止的情况下执行。将每个稀释的第二PCR产物的三微升等分到新的无菌1.5毫升管中，以创建一个混合文库。始终将管子保持在四摄氏度。

测序前一天，从零下20摄氏度取出预填充的即用型试剂盒，并将其置于4摄氏度下进行解冻。在测序当天，将适合1.5毫升离心管的热块设置为96摄氏度，并将杂交缓冲液放在冰上。然后，用水稀释分子级氢氧化钠，并用TE缓冲液稀释即用型对照库。

将16微升的四纳摩尔或混合样品库与四微升的对照库混合在标记为一的新管中。然后，将来自管一的10微升样品与10微升氢氧化钠混合在标记为两的新管中。涡旋和短暂旋转后，将二管在室温下孵育五分钟，然后加入980微升杂交缓冲液。

接下来，在标记为三的新管中，将来自管二的260微升样品与390微升杂交缓冲液混合。通过倒置管子混合内容物后，将其在96摄氏度下孵育两分钟，然后在冰上孵育两分钟。接下来，从冰箱中取出墨盒，并设置样品表，以便使用每个相应的索引一和索引两个适配器进行排序。

从 MiSeq V3 试剂盒中取出流通池后，用无菌分子级 PCR 水轻轻清洁流通池。将整个体积的三管装入墨盒中。然后，在仪器操作软件中，选择排序并按照说明插入流通池、掺入缓冲液和卡式液。

最后，加载样品片并按"运行"开始反应。此序列运行需要三到五天。2019年2月19日从智利梅特里蒙特港收集的18S rRNA元条形码分析用于鉴定海水中存在的藻类物种，产生了13， 750个读数，超过30个藻类物种。

Navicula物种是优势藻类，相对丰度为70.73%，此外，观察到Micromonas，Chaetoceros，Scrippsiella和Prorocentrum物种的丰度足够。假沙托菌属是智利有害藻华的主要致病因素之一，其丰度为0.52%。与18S rRNA基因分析一致，显微镜观察显示Navicula是显性物种，Prorocentrum是次要物种。

根据18S rRNA结果，显微镜记录的12.6%的小的，无法识别的浮游植物细胞可能是微单胞菌。16S rRNA元条形码分析以识别同一水样中的细菌种类，显示31，758次读数超过30种细菌。主要的自由活细菌种类是淀粉杆菌，相对丰度为20.02%，其次是Cladella，为13.53%，Algiphilus为7.06%。

绘制了五个月内从海水中检测到的所有细菌属的相对丰度和时间，以分析某些生物的种群变化。格外清洁至关重要。应使用酒精擦拭、紫外线或高压灭菌材料避免样品污染。

稀释的溶液不应重复使用，管子应始终加盖。通过元条形码进行藻类检测必须与显微镜检查配对。优势物种可以通过显微镜确认，确保在元条形码过程中没有人为错误。

有害藻华破坏海洋生态系统和沿海经济。在智利，藻华杀死了养殖场鲑鱼，破坏了农业养殖。这种元条形码分析将提高智利水华警告的效率。