Este protocolo apresenta uma visão sobre as flores de algas e como monitorar espécies de algas tóxicas de forma eficaz. O procedimento ajuda a fornecer um aviso antecipado das flores de algas para proteger a comunidade de danos associados. A análise de metabarcococo pode detectar muitas espécies em uma amostra ao mesmo tempo, mas requer procedimentos complicados.
Este protocolo explica visualmente cada passo para ajudar a minimizar os erros humanos durante a análise. Os procedimentos de microscopia serão demonstrados por Henry Cameron, da Universidade de Antofagasta, coleta de amostras de Jonathan Vilugron, do Instituto de Fomento Pesquero, pré-tratamento amostral de Karen Vergara, da Universidade de Los Lagos, e análise de metabar codificação por Ignacio Rilling e Marco Campos, da Universidade La Frontera. Comece coletando três litros de amostra de água de um ponto alvo.
Filtre um litro de água para análise de rRNA 16S através de uma filtragem tandem para separar as bactérias livres e anexadas. Em seguida, filtre mais um litro de água para análise de rRNA 18S através de uma única filtragem com uma membrana de 0,2 míccro. Em seguida, usando uma tesoura cirúrgica estéril, corte a membrana filtrada ao meio, enrole metade com papel alumínio para armazenamento, e com a outra metade proceda à extração de DNA com o método Chelex.
Para análise microscópica, transfira um mililitro da amostra de água para um deslizamento de grade de um mililitro usando uma pipeta. Observe a amostra sob um microscópio e registe os nomes e a quantidade da espécie fitoplâncton. Limpe as pipetas no armário do capô laminar com 70% de etanol, seguida pela exposição UV por 30 minutos.
Para a primeira geração de amplicon PCR, aliquot 22,5 microliters da mistura mestre em uma tira de oito tubos seguido por 2,5 microliters da amostra de DNA, em seguida, executar o primeiro ciclo PCR. Em seguida, prepare 100 mililitros de um gel TBE de 2%agarose contendo 10 microliters de uma mancha de gel ácido nucleico. Uma vez que o gel esteja pronto, carregue uma mistura contendo 1,5 microliters de um corante de carregamento de DNA e quatro microliters do produto PCR e realize eletroforese a 100 volts por 30 minutos.
Em seguida, imagem o gel sob luz UV e confirmar a presença de uma banda de 500 a 600 faixas base. Amplicons ausentes às vezes podem ser resolvidos diluindo a amostra para 1.000 vezes com água. Em seguida, use um sistema de limpeza de DNA baseado em contas magnéticas para limpar os primeiros produtos PCR, em seguida, transfira 20 microliters de cada primeiro produto PCR limpo para uma nova placa de 96 poços e selar a placa com uma película Microseal.
Armazene a placa a menos 20 graus Celsius até o próximo passo. Para indexação por segundo PCR, depois de diluir todos os indicadores um e indexar dois primers para uma concentração de micromolar com água de grau PCR em oito tiras pcr tubo, posicionar o índice um primers em uma linha horizontal e indexar dois primers em uma linha vertical. Em seguida, usando uma pipeta multicanal em 2,5 microliters de index one primer para cada poço de uma nova placa de 96 poços.
Em seguida, adicione 12,5 microliters de uma formulação pronta para início quente a cada poço. Em seguida, adicione 2,5 microliters de primer de índice dois e 7,5 microliters do primeiro produto PCR purificado a cada poço. Depois de misturar por pipetting para cima e para baixo 10 vezes, cubra a placa com uma película Microseal e execute o segundo ciclo PCR.
Depois que o PCR estiver completo, coloque a fita de tela de DNA em um analisador de fragmentos. Misture dois microliters de tampão de amostra em três microlitrais do segundo amplificador PCR em novas oito tiras de tubo e insira as tiras no analisador de fragmentos para iniciar a análise. Certifique-se de que os amplificadores pcr segundo são aproximadamente 613 pares de base para ambos os genes 16S e 18S rRNA.
Purifique os segundo produtos PCR usando um sistema de limpeza de DNA de contas magnéticas, como demonstrado anteriormente. Em seguida, meça sua concentração de DNA usando um especttômetro de quantificação de ácido nucleico. Em uma nova placa de 200 microliter 96-well, diluir cada segundo produto PCR purificado com água PCR estéril para quatro nanomoles.
Próximo passo em diante, o protocolo deve ser executado sem parar. Alíquota três microliters de cada segundo produto PCR diluído em um novo tubo estéril de 1,5 mililitro para criar uma biblioteca agrupada. Mantenha sempre o tubo a quatro graus Celsius.
Um dia antes de sequenciar, remova um cartucho de reagente pronto para uso pré-preenchido a partir de menos 20 graus Celsius e coloque-o a quatro graus Celsius para descongelamento. No dia do sequenciamento, coloque um bloco de calor adequado para tubos de centrífugas de 1,5 mililitro a 96 graus Celsius e coloque o tampão de hibridização no gelo. Em seguida, diluir hidróxido de sódio molecular com água e diluir uma biblioteca de controle pronta para uso com tampão de TE.
Misture 16 microlitadores dos quatro nanomole ou biblioteca de amostras agrupadas com quatro microliters da biblioteca de controle em um novo tubo rotulado como um. Em seguida, misture 10 microliters da amostra do tubo um com 10 microliters de hidróxido de sódio em um novo tubo rotulado como dois. Após o vórtice e um breve giro, incubar o tubo dois à temperatura ambiente por cinco minutos e, em seguida, adicionar 980 microliters de tampão de hibridização.
Em seguida, em um novo tubo rotulado como três, misture 260 microliters da amostra do tubo dois com 390 microliters de tampão de hibridização. Depois de misturar o conteúdo invertendo o tubo, incuba-o a 96 graus Celsius por dois minutos, seguido de incubação no gelo por dois minutos. Em seguida, remova o cartucho da geladeira e configure a folha de amostra para sequenciamento com cada índice correspondente um e indexe dois adaptadores.
Depois de remover a célula de fluxo do kit MiSeq V3, limpe suavemente a célula de fluxo com água PCR de grau molecular estéril. Carregue todo o volume do tubo três no cartucho. Em seguida, no software de operação do instrumento, selecione sequenciamento e siga as instruções para inserir célula de fluxo, buffer de incorporação e cartucho.
Por fim, carregue a folha de amostra e pressione Executar para iniciar a reação. Esta sequência leva de três a cinco dias. 18S rRNA metabarcoding analysis para identificar espécies algas presentes na água do mar coletadas em Metri Puerto Montt, Chile em 19 de fevereiro de 2019, rendeu 13.750 leituras, com mais de 30 espécies de algas.
A espécie Navicula foi a algo dominante com uma abundância relativa de 70,73%Além disso, observou-se abundância suficiente para micromonas, Chaetoceros, Scrippsiella e prorocentrum. A espécie Pseudochattonella, um dos principais causadores das flores algas nocivas chilenas, tem uma abundância de 0,52%. Consistente com a análise genética rRNA 18S, a observação microscópica mostrou Navicula como o dominante e Prorocentrum como uma espécie menor.
Os 12,6% das pequenas células fitoplificáveis não identificáveis registradas por microscopia podem ser Micromonas, de acordo com os resultados do rRNA 18S. 16S rRNA metabarcoding analysis para identificar espécies bacterianas na mesma amostra de água mostrou 31.758 leituras com mais de 30 espécies bacterianas. As espécies bacterianas vivas livres dominantes foram a amilobactéria, com uma abundância relativa de 20,02%, seguida por Cladella com 13,53% e Argel em 7,06% A abundância relativa de duas espécies de algas tóxicas, Alexandrium e Pseudochattonella, é traçada no tempo para encontrar um padrão de crescimento único.
A abundância relativa de todos os gêneros bacterianos em ordens detectadas a partir da água do mar ao longo de cinco meses é traçada e o tempo causado para analisar a mudança populacional de certos organismos. É crucial ser extra limpo. A contaminação da amostra deve ser evitada usando um lenço de álcool, luz UV ou autoclaving do material.
As soluções diluídas não devem ser reutilizadas e os tubos devem ser sempre tampados. A detecção de algas por metabarcocos deve ser emparelhada com microscopia. A espécie dominante pode ser confirmada por microscopia garantindo nenhum erro humano durante processos de metabarização.
As flores algas prejudiciais prejudicam o ecossistema marinho e a economia costeira. No Chile, as flores de algas matam salmão de fazenda, prejudicando as águas. Esta análise de metabar codificação aumentará a eficiência dos avisos de flores no Chile.
