このプロトコルは、藻類の花と有毒藻類種を効果的に監視する方法についての洞察を提示します。この手順は、関連する損害からコミュニティを保護するために藻類の花の早期警告を提供するのに役立ちます。メタバーコーディング解析では、サンプル内の多くの種を一度に検出できますが、複雑な手順が必要です。
このプロトコルは、分析中の人為的ミスを最小限に抑えるために、各ステップを視覚的に説明します。顕微鏡の手順は、アントファガスタ大学のヘンリー・キャメロン、インスティトゥート・デ・フォメント・ペスケロのジョナサン・ヴィルグロンによるサンプルコレクション、ロス・ラゴス大学のカレン・ヴェルガラによるサンプル前処理、ラ・フロンテラ大学のイグナシオ・リリングとマルコ・カンポスによるメタバーコーディング分析によって実証されます。まず、ターゲットスポットから3リットルの水サンプルを採取します。
タンデム濾過を通して16S rRNA分析のために水の1リットルをフィルターし、自由な生物と付属の細菌を分離します。次に、0.2ミクロンの膜を用いた単一のろ過を通して18S rRNA分析のために別の1リットルの水をろ過します。次に、無菌手術用ハサミを使用して、濾過した膜を半分に切り、半分をアルミホイルで包んで貯蔵し、残りの半分はチェレックス法でDNA抽出に進む。
顕微鏡分析のために、水サンプルの1ミリリットルをピペットを使用して1ミリリットルのグリッドスライドに移します。サンプルを顕微鏡で観察し、植物プランクトン種の名前と量を記録します。70%エタノールを用いた薄層フードキャビネット内のピペットを洗浄し、その後30分間UV曝露を行います。
最初のPCRアンプリコン生成では、8つのチューブストリップにマスターミックスのアリコート22.5マイクロリットル、続いてDNAサンプル2.5マイクロリットルを続け、最初のPCRサイクルを実行します。次に、10マイクロリットルの核酸ゲル染色を含む2%アガロースTBEゲルの100ミリリットルを調製する。ゲルの準備ができたら、1.5マイクロリットルのDNAローディング色素と4マイクロリットルのPCR産物を含む混合物をロードし、100ボルトで30分間電気泳動を行います。
次に、UV光下でゲルを画像化し、500~600塩基対帯の存在を確認します。アンプリコンが欠けている場合、サンプルを水で1,000倍に希釈することで解決できる場合があります。次に、磁気ビーズベースのDNAクリーンアップシステムを使用して最初のPCR製品を洗浄し、洗浄した最初のPCR製品の20マイクロリットルを新しい96ウェルプレートに移し、マイクロシールフィルムでプレートを密封します。
次のステップまでマイナス20°Cでプレートを保管してください。2 番目の PCR によるインデックス化の場合、8 本のチューブ PCR ストリップ内の PCR グレード水を含む 2 つのプライマーを 1 マイクロモル濃度に希釈した後、1 つのプライマーを水平行に配置し、2 つのプライマーを縦列にインデックスします。次いで、新しい96ウェルプレートの各ウェルに2.5マイクロリットルのインデックス1プライマーでマルチチャネルピペットを使用する。
次に、ホットスタートの準備整った製剤の12.5マイクロリットルを各井戸に加えます。次に、2.5マイクロリットルのインデックス2プライマーと精製した最初のPCR産物の7.5マイクロリットルを各ウェルに加えます。10回上下にピペットで混合した後、マイクロシールフィルムでプレートを覆い、2回目のPCRサイクルを実行します。
PCR が完了したら、DNA スクリーン テープをフラグメント分析装置に入れます。新しい8つのチューブストリップに2番目のPCRアンプリコンの3マイクロリットルにサンプルバッファーの2マイクロリットルを混合し、分析を開始するために断片分析装置にストリップを挿入します。2番目のPCRアンプリコンは、16Sおよび18S rRNA遺伝子の両方に対して約613塩基対であることを確認してください。
先に示したように、磁気ビーズDNAクリーンアップシステムを使用して、2番目のPCR製品を精製します。次に、核酸定量分光光度計を用いてそれらのDNA濃度を測定する。新しい200マイクロリットル96ウェルプレートで、各精製された2番目のPCR製品を滅菌PCR水で4つのナノモルに希釈します。
次のステップでは、プロトコルを停止せずに実行する必要があります。アリコートは、新しい滅菌1.5ミリリットルチューブで希釈された第2PCR産物の3マイクロリットルをプールされたライブラリーを作成する。常にチューブを摂氏4度に保ちます。
シーケンシングの前日に、プレフィルドのすぐに使用できる試薬カートリッジをマイナス20°Cから取り出し、解凍のために摂氏4度にします。シーケンシングの日には、1.5ミリリットルの遠心管に適したヒートブロックを摂氏96度に設定し、ハイブリダイゼーションバッファーを氷の上に置きます。次に、分子グレードの水酸化ナトリウムを水で希釈し、TEバッファーですぐに使用できる制御ライブラリを希釈します。
4つのナノモルまたはプールされたサンプルライブラリの16マイクロリットルを、コントロールライブラリの4マイクロリットルと1つとしてラベル付けされた新しいチューブに混ぜます。次に、2つとしてラベル付けされた新しいチューブに10マイクロリットルの水酸化ナトリウムをチューブ1から10マイクロリットル混合します。ボルテックスと短いスピンの後、チューブ2を室温で5分間インキュベートし、980マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーを追加します。
次に、3個のラベルを付けた新しいチューブに、チューブ2から260マイクロリットルのサンプルを390マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーと混合する。チューブを反転させて内容物を混合した後、摂氏96度で2分間インキュベートし、続いて氷の上で2分間インキュベーションします。次に、冷蔵庫からカートリッジを取り出し、対応するインデックス1とインデックス2アダプタでシーケンス処理用のサンプルシートを設定します。
MiSeq V3キットからフローセルを取り外した後、滅菌分子グレードPCR水で流量セルを静かに洗浄します。チューブ3の全容をカートリッジに積み込みます。次に、計測器操作ソフトウェアで、シーケンスを選択し、指示に従ってフローセル、インコーションバッファ、カートリッジを挿入します。
最後に、サンプルシートをロードし、実行を押して反応を開始します。このシーケンス実行には 3 ~ 5 日かかります。2019年2月19日にチリのメトリプエルトモントから採取された海水中に存在する藻類種を同定するための18S rRNAメタバーコーディング分析は、30種以上の藻類種で13,750読み取りを行いました。
ナビキュラ種は、70.73%の相対的な豊富を有する支配的なアルゴであったが、また、十分な存在量がマイクロモナス、チャエトセロス、スクリプシエラ、およびプロロセントラム種に対して観察された。チリの有害藻類の花の主要な原因の一つであるシュードチャットネラ種は、0.52%の豊富さを持っています。18S rRNA遺伝子解析と一致して、顕微鏡観察はナビキュラを支配的、プロロセントラムをマイナー種として示した。
18S rRNAの結果によると、顕微鏡によって記録された小さな、識別できない植物プランクトン細胞の12.6%はマイクロモナスである可能性があります。同じ水サンプル中の細菌種を同定する16S rRNAメタバーコーディング分析は、30種以上の細菌種で31,758読み取りを示した。支配的な自由生物細菌種はアミリバクターで、相対的な存在量は20.02%、次いでクラデラが13.53%、アルギフィルスが7.06%で、アレクサンドリウムとシュードチャットネラの2つの有毒藻類種の相対的な存在は、ユニークな成長パターンを見つけるために時間内にプロットされています。
5ヶ月にわたって海水から検出されたオーダーにおけるすべての細菌属の相対的な存在量がプロットされ、特定の生物の個体数変化を分析するために時間が生じる。余分な清潔であることが重要です。サンプル汚染は、アルコール拭き、紫外線、または材料のオートクレーブを使用して避けるべきです。
希釈された溶液は再利用されるべきではなく、チューブは常にキャップする必要があります。メタバーコーディングによる藻類検出は顕微鏡と対にする必要があります。支配的な種は、メタバーコーディングプロセス中に人為的ミスを保証しない顕微鏡検査によって確認することができる。
有害な藻類の花は、海洋生態系と沿岸経済にダメージを与えます。チリでは、藻類の花が農場のサケを殺し、アグアカルチャーに損害を与えます。このメタバーコーディング分析は、チリのブルーム警告の効率を高めます。
