이 프로토콜은 조류 꽃과 독성 조류 종을 효과적으로 모니터링하는 방법에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차는 관련 손해로부터 지역 사회를 보호하기 위해 조류 꽃의 조기 경고를 제공하는 데 도움이됩니다. 메타바코딩 분석은 한 번에 샘플에서 많은 종을 감지할 수 있지만 복잡한 절차가 필요합니다.
이 프로토콜은 분석 중에 사람의 오류를 최소화하는 데 도움이 되는 각 단계를 시각적으로 설명합니다. 현미경 검사는 안토파가스타 대학의 헨리 카메론, 인스티투토 데 포멘토 페스케로의 조나단 빌루그론의 샘플 수집, 로스 라고스 대학의 카렌 베르가라샘플 전처리, 라 프론테라 대학의 이그나시오 릴링과 마르코 캄포스의 메타바코딩 분석에 의해 입증될 것입니다. 먼저 대상 지점에서 3리터의 물 샘플을 수집합니다.
16S rRNA 분석을 위해 1리터의 물을 걸러내고, 탠덤 여과를 통해 자유생활과 부착된 박테리아를 분리한다. 다음으로, 0.2 미크론 멤브레인을 가진 단일 여과를 통해 18S rRNA 분석을 위해 또 다른 1리터의 물을 필터링한다. 이어서, 멸균 수술 가위를 사용하여 여과된 멤브레인을 반으로 자르고, 저장을 위해 알루미늄 호일로 반쪽을 감싸고, 나머지 절반은 Chelex 방법으로 DNA 추출을 진행한다.
현미경 분석을 위해, 파이펫을 사용하여 1 밀리리터 그리드 슬라이드에 물 샘플의 1 밀리리터를 전송합니다. 현미경의 밑에 견본을 관찰하고 식물성 플랑크톤 종의 이름과 양을 기록합니다. 70%에탄올로 라미나르 후드 캐비닛에 깨끗한 파이펫을, 30분 동안 UV 노출이 이어진다.
첫 번째 PCR 앰플리턴 생성을 위해, 8개의 튜브 스트립에서 마스터 믹스의 알리쿼트 22.5 마이크로리터가 DNA 샘플의 2.5 마이크로리터가 그 뒤를 잇고 첫 번째 PCR 주기를 실행한다. 다음으로, 핵산 젤 얼룩의 10 마이크로리터를 포함하는 2% 아가로즈 TBE 젤의 100 밀리리터를 준비한다. 젤이 준비되면 DNA 적재 염료 1.5 마이크로리터와 PCR 제품의 4 마이크로리터를 함유한 혼합물을 적재하고 30분 동안 100볼트에서 전기전도를 수행합니다.
이어서, UV 빛 아래에서 젤을 이미지화하고 500 ~ 600베이스 페어 밴드의 존재를 확인한다. 누락 된 앰플리톤은 때때로 물로 샘플을 1, 000 배로 희석하여 해결할 수 있습니다. 다음으로, 마그네틱 비즈 기반 DNA 정리 시스템을 사용하여 첫 번째 PCR 제품을 청소한 다음, 청소된 각 최초의 PCR 제품의 20마이크로리터를 새로운 96웰 플레이트로 전송하고 마이크로씰 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
다음 단계까지 접시를 영하 20도에 보관하십시오. 두 번째 PCR별 인덱싱의 경우, 모든 인덱스 1을 희석한 후 두 프라이머를 PCR 등급의 물을 PCR 등급으로 하나의 마이크로몰러 농도로 희석한 후, 인덱스 1프라이머를 가로행에 배치하고 두 프라이머를 수직 행에 색인한다. 그런 다음 인덱스 1 프라이머의 2.5 마이크로리터에서 멀티 채널 파이펫을 사용하여 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 사용한다.
다음으로, 각 웰에 핫 스타트 준비 제형의 12.5 마이크로리터를 추가합니다. 이어서, 2.5 마이크로리터의 2개의 프라이머와 7.5 마이크로리터를 각각 양분에 첨가한다. 10회 위아래로 파이펫팅하여 혼합한 후, 마이크로씰 필름으로 플레이트를 덮고 두 번째 PCR 사이클을 실행합니다.
PCR이 완료되면 DNA 스크린 테이프를 단편 분석기에 배치합니다. 두 번째 PCR 앰플리톤의 3개의 마이크로리터에 샘플 버퍼 2개를 새로운 8개의 튜브 스트립에 혼합하고 스트립을 단편 분석기에 삽입하여 분석을 시작합니다. 두 번째 PCR 앰플리턴이 16S 및 18S rRNA 유전자 모두에 대해 약 613개의 염기 쌍인지 확인합니다.
이전에 설명한 바와 같이 자기 구슬 DNA 정화 시스템을 사용하여 두 번째 PCR 제품을 정화합니다. 그런 다음 핵산 정량화 분광계를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. 새로운 200 마이크로리터 96웰 플레이트에서 멸균 PCR 물로 정제된 두 번째 PCR 제품을 4나노몰로 희석합니다.
다음 단계는 프로토콜을 중지하지 않고 수행해야 합니다. Aliquot는 새로운 멸균 1.5 밀리리터 튜브에 각 희석 된 두 번째 PCR 제품의 3 마이크로 리터를 작성하여 풀 라이브러리를 만듭니다. 항상 4섭씨에서 튜브를 유지하십시오.
시퀀싱 하기 하루 전에, 영하 20도에서 미리 채워진 즉시 사용 시약 카트리지를 제거하고 해동을 위해 섭씨 4도에 놓습니다. 시퀀싱 당일, 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 적합한 열 블록을 섭씨 96도로 설정하고 혼성화 버퍼를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음, 물로 분자 등급 의 수산화 나트륨을 희석하고 TE 버퍼로 즉시 사용 제어 라이브러리를 희석시십시오.
4개의 나노몰 또는 풀로 풀로 된 샘플 라이브러리의 16마이크로리터를 제어 라이브러리의 4개의 마이크로리터와 하나로 표시된 새로운 튜브에 혼합합니다. 그런 다음, 2개로 표시된 새로운 튜브에 수산화 나트륨 10 마이크로리터와 튜브 1개에서 샘플10 마이크로리터를 혼합합니다. 소용돌이와 짧은 스핀 후, 5 분 동안 실온에서 튜브 2개를 인큐베이션 한 다음 하이브리드화 버퍼의 980 마이크로 리터를 추가하십시오.
다음으로, 3개로 표시된 새로운 튜브에서, 390 마이크로리터의 혼성화 완충제와 튜브 2에서 샘플의 260 마이크로리터를 혼합한다. 튜브를 반전시켜 내용기를 혼합한 후 2분 동안 섭씨 96도에서 배양한 다음 2분 동안 얼음에 잠복합니다. 다음으로, 냉장고에서 카트리지를 제거하고 각 해당 인덱스 1과 인덱스 두 어댑터를 사용하여 시퀀싱을 위해 샘플 시트를 설정합니다.
MiSeq V3 키트에서 유동 세포를 제거한 후 멸균 분자 등급 PCR 물로 유동 세포를 부드럽게 청소합니다. 튜브 3의 전체 볼륨을 카트리지에 로드합니다. 그런 다음 계측기 작동 소프트웨어에서 순서를 선택하고 지침을 따라 유량 셀, 통합 버퍼 및 카트리지를 삽입합니다.
마지막으로 샘플 시트를 로드하고 실행을 눌러 반응을 시작합니다. 이 시퀀스 실행은 3~5일이 소요됩니다. 18S rRNA 메타바코딩 분석을 통해 2019년 2월 19일 칠레 멧트리 푸에르토 몬트에서 수집된 해수에 존재하는 조류 종을 식별하기 위해 30종 이상의 조류 종으로 13, 750개의 읽기를 산출했습니다.
나비불라 종은 70.73 %의 상대적 풍부도 지배적 인 알고였으며, 마이크로모나스, 채토 세로스, 스크립시엘라 및 프로로 센트럼 종에 대한 충분한 풍요로움이 관찰되었습니다. 칠레 유해 조류 꽃의 주요 원인 중 하나인 슈도차트토넬라 종은 0.52%의 풍부를 가지고 있습니다. 18S rRNA 유전자 분석과 일치, 현미경 관찰은 작은 종으로 지배적인 및 Prorocentrum로 Navicula를 보여주었습니다.
18S rRNA 결과에 따르면 현미경 검사법에 의해 기록된 작은, 식별할 수 없는 식물성 식물성 플랑크톤 세포의 12.6%는 마이크로모나일 수 있었습니다. 16S rRNA 메타바코딩 분석은 동일한 물 샘플에서 세균종을 식별하기 위해 31, 758개 이상의 세균종을 판독한 것으로 나타났다. 지배적 인 무료 살아있는 세균종은 아밀리박터였으며, 상대적으로 풍요로운 20.02%의 클라델라가 13.53%로 뒤를 이었고, 알지필루스는 7.06%로 두 개의 독성 조류종인 알렉산드리움과 슈도차트토넬라의 상대적 풍부함으로 독특한 성장 패턴을 찾는 데 시간이 정해되어 있다.
5개월 이상 해수에서 검출된 주문에 있는 모든 세균속의 상대적인 풍부는 특정 유기체의 인구 변화를 분석하기 위하여 기인하고 시간 플롯됩니다. 그것은 여분의 깨끗 한 것이 중요 하다. 시료 오염은 알코올 닦기, 자외선 또는 재료를 자동화하여 피해야 합니다.
희석 된 솔루션을 재사용해서는 안되며 튜브는 항상 제한되어야합니다. 대사코드에 의한 조류 검출은 현미경 검사법과 결합되어야 합니다. 지배적 인 종은 대사 코딩 과정에서 인간의 오류를 보장 현미경 검사법에 의해 확인 될 수있다.
유해한 조류 꽃은 해양 생태계와 해안 경제를 손상시합니다. 칠레에서는 조류꽃이 농장 연어를 죽이고 아구아문화를 손상시니다. 이 메타바코딩 분석은 칠레에서 꽃 경고의 효율성을 증가시킬 것입니다.
