Bu protokol, alg çiçeklenmeleri ve toksik alg türlerinin etkili bir şekilde nasıl izleneceği hakkında fikir sunar. Prosedür, toplumu ilişkili hasarlardan korumak için alg çiçeklerinin erken uyarısını sağlamaya yardımcı olur. Metabarcoding analizi bir örnekteki birçok türü aynı anda tespit edebilir, ancak karmaşık prosedürler gerektirir.
Bu protokol, analiz sırasında insan hatalarını en aza indirmeye yardımcı olmak için her adımı görsel olarak açıklar. Mikroskopi işlemleri Antofagasta Üniversitesi'nden Henry Cameron, Instituto de Fomento Pesquero'dan Jonathan Vilugron tarafından örnek toplama, Los Lagos Üniversitesi'nden Karen Vergara tarafından numune ön tedavisi ve La Frontera Üniversitesi'nden Ignacio Rilling ve Marco Campos tarafından metabarkodlama analizi gösterilecektir. Hedef noktadan üç litre su örneği toplayarak başlayın.
Serbest yaşayan ve bağlı bakterileri ayırmak için bir tandem filtrasyon yoluyla 16S rRNA analizi için suyun bir litresini filtreleyin. Daha sonra, 0,2 mikron membranlı tek bir filtrasyon yoluyla 18S rRNA analizi için bir litre daha su filtreleyin. Daha sonra steril cerrahi makas kullanarak filtrelenmiş zarı ikiye bölün, bir yarısını depolama için alüminyum folyo ile sarın ve diğer yarısı ile Chelex yöntemi ile DNA ekstraksiyonuna geçin.
Mikroskobik analiz için, su örneğinin bir mililitresini pipet kullanarak bir mililitrelik ızgara kaydırağı üzerine aktarın. Örneği mikroskop altında gözlemleyin ve fitoplankton türlerinin adlarını ve miktarını kaydedin. Laminar davlumbaz dolabındaki pipetleri% 70 etanol ile temizleyin, ardından 30 dakika boyunca UV maruziyeti.
İlk PCR amplicon üretimi için, sekiz tüp şeridinde ana karışımın aliquot 22.5 mikrolitresi ve ardından DNA örneğinin 2.5 mikrolitresi, ardından ilk PCR döngüsünü çalıştırın. Daha sonra, nükleik asit jel lekesinin 10 mikrolitresini içeren% 2 agarose TBE jelinin 100 mililitresini hazırlayın. Jel hazır olduğunda, 1,5 mikrolitre DNA yükleme boyası ve PCR ürününün dört mikrolitresini içeren bir karışım yükleyin ve 30 dakika boyunca 100 voltta elektroforez yapın.
Ardından, jeli UV ışığı altında görüntüleyin ve 500 ila 600 baz çift bandının varlığını onaylayın. Eksik ampliconlar bazen numuneyi su ile 1.000 kata seyrelterek çözülebilir. Daha sonra, ilk PCR ürünlerini temizlemek için manyetik boncuk bazlı bir DNA temizleme sistemi kullanın, ardından temizlenen her ilk PCR ürününün 20 mikrolitresini yeni bir 96 kuyu plakasına aktarın ve plakayı bir Mikroseal filmle kapatın.
Tabağı bir sonraki adıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. İkinci PCR ile indeksleme için, tüm dizin bir ve dizin iki astarı sekiz tüp PCR şeridinde PCR sınıfı su ile bir mikromolar konsantrasyona indeks ettikten sonra, dizini bir astarı yatay bir satırda konumlandırın ve iki astarı dikey bir satırda dizin. Daha sonra, yeni bir 96 kuyu plakasının her kuyusuna 2,5 mikrolitre dizin bir astarda çok kanallı bir pipet kullanarak.
Ardından, her kuyuya 12,5 mikrolitre sıcak başlangıç hazır formülasyonu ekleyin. Ardından, her kuyuya 2,5 mikrolitre indeks iki astar ve saflaştırılmış ilk PCR ürününün 7,5 mikrolitresini ekleyin. 10 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırdıktan sonra, plakayı bir Microseal filmle kaplayın ve ikinci PCR döngüsünü çalıştırın.
PCR tamamlandıktan sonra, DNA ekran bandını bir parça analizörüne yerleştirin. İkinci PCR amplicon'un üç mikrolitresinde iki mikrolitre numune tamponu yeni sekiz tüp şeridinde karıştırın ve analize başlamak için şeritleri parça analizörüne yerleştirin. İkinci PCR ampliconlarının hem 16S hem de 18S rRNA genleri için yaklaşık 613 baz çift olduğundan emin olun.
Daha önce gösterildiği gibi manyetik boncuk DNA temizleme sistemi kullanarak ikinci PCR ürünlerini saflaştırın. Daha sonra nükleik asit nicelleştirme spektrofotometresi kullanarak DNA konsantrasyonlarını ölçün. Yeni bir 200 mikroliter 96 kuyu plakasında, her saflaştırılmış ikinci PCR ürününü steril PCR suyu ile dört nanomole seyreltin.
Bir sonraki adımda, protokol durdurulmadan gerçekleştirilmelidir. Havuzlu bir kütüphane oluşturmak için yeni bir steril 1,5 mililitre tüpte seyreltilmiş her ikinci PCR ürününün üç mikrolitresini aliquot. Tüpü her zaman 4 santigrat derecede tut.
Sıralamadan bir gün önce, önceden doldurulmuş kullanıma hazır bir reaktif kartuşunu eksi 20 santigrat dereceden çıkarın ve çözülme için dört santigrat dereceye yerleştirin. Sıralama gününde, 1,5 mililitre santrifüj tüpleri için uygun bir ısı bloğunu 96 santigrat dereceye ayarlayın ve hibridizasyon tamponunu buza yerleştirin. Daha sonra moleküler sınıf sodyum hidroksit su ile seyreltin ve kullanıma hazır bir kontrol kitaplığını TE tamponu ile seyreltin.
Dört nanomole veya havuza alınan örnek kütüphanenin 16 mikrolitresini, kontrol kütüphanesinin dört mikrolitresiyle tek olarak etiketlenmiş yeni bir tüpte karıştırın. Daha sonra, bir numaralı tüpten alınan numunenin 10 mikrolitresini iki olarak etiketlenmiş yeni bir tüpte 10 mikrolitre sodyum hidroksit ile karıştırın. Girdaplama ve kısa bir dönüş yaptıktan sonra, tüp ikiyi oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın, ardından 980 mikrolitre hibridizasyon tamponu ekleyin.
Daha sonra, üç olarak etiketlenmiş yeni bir tüpte, 260 mikrolitrelik numuneyi tüp ikiden 390 mikrolitre hibridizasyon tamponu ile karıştırın. Tüpü ters çevirerek içeriği karıştırdıktan sonra, iki dakika boyunca 96 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından iki dakika boyunca buz üzerinde inkübasyon yapın. Ardından, kartuşu buzdolabından çıkarın ve örnek sayfayı ilgili her dizin bir ve dizin iki bağdaştırıcı ile sıralama için ayarlayın.
Akış hücresini MiSeq V3 kitinden çıkardıktan sonra, akış hücresini steril moleküler sınıf PCR su ile hafifçe temizleyin. Üç numaralı tüpün tüm hacmini kartuşa yükleyin. Ardından, cihaz çalışma yazılımında sıralamayı seçin ve akış hücresi, birleştirme tamponu ve kartuş eklemek için yönergeleri izleyin.
Son olarak, örnek sayfayı yükleyin ve reaksiyona başlamak için Çalıştır'a basın. Bu sıralı çalışma üç ila beş gün sürer. 19 Şubat 2019'da Şili'nin Metri Puerto Montt kentinden toplanan deniz suyunda bulunan alg türlerini tanımlamak için yapılan 18S rRNA metabarkodlama analizi, 30'dan fazla alg türüyle birlikte 13.750 okuma yaptı.
Navicula türü% 70.73'lük göreceli bolluk ile baskın algo idi ayrıca, Mikromonlar, Chaetoceros, Scrippsiella ve Prorocentrum türleri için yeterli bolluk gözlendi. Şili zararlı alg çiçeklerinin önemli nedenlerinden biri olan Pseudochattonella türü% 0.52 bolluğa sahiptir. 18S rRNA gen analizi ile uyumlu olarak, mikroskobik gözlem Navicula'yı baskın ve Prorocentrum'u küçük bir tür olarak gösterdi.
18S rRNA sonuçlarına göre mikroskopi ile kaydedilen küçük, tanımlanamayan fitoplankton hücrelerinin %12,6'sı Mikromon olabilir. Aynı su örneğinde bakteri türlerini tanımlamak için yapılan 16S rRNA metabarkodlama analizinde 31, 758 okumada 30'dan fazla bakteri türü görüldü. Baskın serbest yaşayan bakteri türleri Amylibacter idi, göreceli bolluk% 20.02 ile% 13.53'te Cladella ve% 7.06'da Algiphilus, iki toksik alg türünün göreceli bolluğu, Alexandrium ve Pseudochattonella, benzersiz bir büyüme paterni bulmak için zamanında çizildi.
Beş ay boyunca deniz suyundan tespit edilen siparişlerdeki tüm bakteri cinsinin göreceli bolluğu çizilir ve zaman belirli organizmaların popülasyon değişimini analiz etmeye neden edilir. Ekstra temiz olmak çok önemlidir. Numune kontaminasyonu alkol silme, UV ışığı veya malzemenin otomatik olarak kapatılarak önlenmelidir.
Seyreltilmiş çözeltiler tekrar kullanılmamalı ve tüpler her zaman kapatılmalıdır. Metabarkodlama ile alg tespiti mikroskopi ile eşleştirilmelidir. Baskın türler, metabarkodlama işlemleri sırasında insan hatası olmamasını sağlayan mikroskopi ile doğrulanabilir.
Zararlı alg çiçekleri deniz ekosistemine ve kıyı ekonomisine zarar verir. Şili'de alg çiçekleri çiftlik somonlarını öldürür ve aguakültürlere zarar verir. Bu metabarkod analizi Şili'deki çiçeklenme uyarılarının verimliliğini artıracaktır.
