许多候选亚单位疫苗抗原是膜蛋白。从历史上看，这些很难生产和纯化足够的数量。通过这种技术，我们能够创建嵌入脂质膜内的目标抗原，以帮助确保天然的确认。
该过程还有助于使用感兴趣的佐剂进行配制。无细胞表达能够在其天然无标签结构中快速产生感兴趣的蛋白质。这项技术也是可扩展的，我们已经在与商业公司合作，使用这种方法开发疫苗配方。
我们在这里展示了衣原体抗原的过程，但该过程可以很容易地适应产生感兴趣的抗原，无论它们是否是膜蛋白。这个过程可能适用于病原体和癌症疫苗的开发。首先，通过采用无细胞方法制备MOMP-tNLP。
在设置反应前两小时从无细胞蛋白表达试剂盒中解冻复溶缓冲液，并将不含EDTA的蛋白酶抑制剂添加到缓冲液中。使用设计用于运行五次一毫升反应的试剂盒。对于每一毫升反应，向大肠杆菌裂解物瓶中加入525微升复溶缓冲液并将其滚动溶解。
将250微升复溶缓冲液加入含有添加剂的反应瓶中，并通过滚动溶解。接下来，向反应进料瓶中加入8.1毫升复溶缓冲液并滚动使其溶解。在一瓶氨基酸混合物中，加入三毫升复溶缓冲液使其溶解。
在另一瓶蛋氨酸中，加入1.8毫升复溶缓冲液，溶解后储存在冰上。向大肠杆菌裂解物瓶中加入225微升重组混合物，270微升不含蛋氨酸的重组氨基酸混合物和30微升重组蛋氨酸。此外，向混合物中加入400微升DMPC/端胶质素混合物15微克MONP质粒和0.6微克delta-49ApoA1并混合。
在1.5毫升管中等分20微升总溶液用于表达GFP的对照反应。通过加入2.65毫升不含蛋氨酸的重组氨基酸混合物和300微升重组蛋氨酸来制备饲料溶液。将一毫升反应溶液转移到无细胞反应试剂盒中的内部反应室中并密封。
用10毫升进料溶液填充反应容器的外室并关闭它。将0.5微升GFP对照质粒加入反应混合物的20微升等分试样中。将反应物放入摇床中，每分钟300转，在30摄氏度下旋转18小时。
15分钟后在紫外光下监测反应，以观察由于GFP合成引起的荧光。通过使用 delta-49ApoA1 蛋白上的 HIS 标签固定化镍亲和色谱法，从无细胞反应混合物中纯化 MOMP-tNLP 纳米颗粒复合物。将1毫升HIS-tag纯化树脂的50%浆液转移到10毫升一次性色谱柱中，并加入3毫升结合缓冲液以平衡。
之后，排干缓冲液并向树脂中加入250微升结合缓冲液。提取20微升无细胞反应混合物用于SDS-PAGE分析。将剩余的无细胞反应混合物与平衡树脂一起加入，并在实验室摇杆上以四摄氏度孵育一小时。
取下柱盖并用500微升结合缓冲液洗涤。将洗涤液添加到色谱柱中并收集流出液以进行SDS-PAGE分析。用一毫升洗涤缓冲液用20毫摩尔咪唑洗涤柱六次并收集馏分。
第二次洗涤时，使用一毫升移液管搅拌树脂。在含有250毫摩尔咪唑的洗脱缓冲液I的六个300微升馏分和含有500毫摩尔咪唑的300微升洗脱缓冲液II的最终洗脱中洗脱MOMP-tNLP。在第二次洗脱时，使用一毫升移液器上下移液剧烈搅拌树脂。
使用凝胶成像仪捕获600纳米的图像。然后，使用蛋白质标准品通过SDS-PAGE分析量化纳米颗粒中不同蛋白质的量。使用 MOMP 波段的密度绘制标准曲线。
然后，用标准品确定纳米颗粒的MONP成分。通过SDS-PAGE分离样品，并使用商业干转系统转移凝胶组进行蛋白质印迹分析。从堆栈中取出印迹，并在含有0.2%吐温20和0.5微克/毫升MAb40或0.2微克/毫升MAb1蛋白的HIS标签的封闭缓冲液中以4摄氏度的温度孵育过夜。
用PBST洗涤每个印迹膜三次，每次洗涤五分钟。将印迹膜在含有与荧光团偶联的二抗的封闭缓冲液中孵育一小时，稀释度为1:10， 000。用PBST重复洗涤，并在最后一次洗涤后使用荧光成像仪捕获图像。
使用斑点印迹仪，印迹三微克MOMP-tNLP和空tNLP。使用与蛋白质印迹相同的方法显影和封闭印迹。将混合溶液冷冻在干冰上，并使用冻干机冻干过夜。
将干燥的配方储存在零下20摄氏度。需要时，用无内毒素水重新配制冻干的tNLP，并将其滚动以溶解和再水化。用PBS透析溶液，并用3.5千道尔顿截止透析膜去除海藻糖。
在加入佐剂之前，在真空浓缩器中离心纳米颗粒溶液。20至30分钟后监测样品体积，以防止完全干燥。在生物安全柜中，在无菌条件下添加佐剂。
使用分析体积排阻色谱分析配方以成功掺入。将佐剂 MOMP-tNLP 和空 tNLP 储存在 4 摄氏度下长达 14 天。使用体积排阻色谱分析tNLP配方的稳定性。
通过镍亲和色谱对MOMP-tNLP进行SDS-PAGE分析，结果表明无细胞反应混合物对MOMP和delta-49ApoA1蛋白均具有高水平表达。通过采用凝胶密度测定法，使用以已知浓度为标准的纯化重组MOMP对MONP浓度进行定量。为了确定低聚物的形成，用热和DTT处理SDS-PAGE MOMP和MOMP-tNLP，MOMP和delta-49ApoA1显示出不同的条带。
使用抗体MAb40对MOMP蛋白进行蛋白质印迹分析，揭示了条带模式，证实了MONP蛋白在其非变性状态下形成的低聚物。在MAb40和MAbHIS抗体存在下进行斑点印迹测定，表明MOMP-tNLP的形成。然而，空的tNLP显示出MAbHIS的积极信号。
注射佐剂MOMP-tNLP的免疫小鼠血清显示出强烈的MOMP结合，并表明MOMP-tNLP可以引发免疫反应。由于该协议从DNA中产生蛋白质，因此必须避免用DNase，RNAase以及外来DNA和RNA污染反应。反应中使用的任何材料或试剂都应不含这些类型的分子。
在表达、纯化和添加佐剂后，可以在适当的动物模型中评估感兴趣的病原体，以评估免疫激活标志物或评估激发期间的保护。对于衣原体，主要的外膜蛋白（MOMP）多年来一直被认为是亚单位疫苗的主要候选抗原，但很难在疫苗应用所需的规模上生产。这种膜蛋白的无细胞共表达是一种可行的方法，可以开始将这种蛋白质转移到小鼠等动物模型中进行评估，并最终进入人体测试。
