Birçok aday alt birim aşı antijeni membran proteinleridir. Tarihsel olarak, bunların yeterli miktarlarda üretilmesi ve saflaştırılması zor olmuştur. Bu teknikle, doğal benzeri bir doğrulama sağlamaya yardımcı olmak için bir lipit zarı içine gömülü ilgilenilen antijenleri oluşturabiliyoruz.
Bu işlem aynı zamanda ilgilenilen adjuvanlarla formülasyonu da kolaylaştırır. Hücresiz ekspresyon, doğal etiketsiz yapılarında ilgilenilen proteinlerin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu teknik aynı zamanda ölçeklenebilir ve bu süreci kullanarak aşı formülasyonları geliştirmek için ticari şirketlerle zaten çalışıyoruz.
Burada bir klamidya antijeni için süreci gösteriyoruz, ancak süreç, membran proteinleri olup olmadıklarına bakılmaksızın ilgilenilen antijenleri üretmek için kolayca uyarlanabilir. Bu süreç hem patojen hem de kanser aşısı geliştirme için geçerli olabilir. Başlamak için, hücresiz bir yöntem kullanarak MOMP-tNLP'leri hazırlayın.
Reaksiyonu ayarlamadan iki saat önce sulandırma tamponunu hücresiz protein ekspresyon kitinden çözün ve tampona EDTA içermeyen proteaz inhibitörü ekleyin. Beş adet bir mililitrelik reaksiyon çalıştırmak için tasarlanmış bir kit kullanın. Her bir mililitrelik reaksiyon için, E.coli lizat şişesine 525 mikrolitre sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için yuvarlayın.
Katkı maddesini içeren reaksiyon şişesine 250 mikrolitre sulandırma tamponu ekleyin ve yuvarlayarak çözün. Ardından, reaksiyon besleme şişesine 8.1 mililitre sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için yuvarlayın. Bir şişe amino asit karışımına, çözmek için üç mililitre sulandırma tamponu ekleyin.
Başka bir metiyonin şişesine 1.8 mililitre sulandırma tamponu ekleyin, çözün ve buz üzerinde saklayın. E.coli lizat şişesine 225 mikrolitre sulandırılmış karışım, 270 mikrolitre metiyoninsiz sulandırılmış amino asit karışımı ve 30 mikrolitre sulandırılmış metiyonin ekleyin. Ayrıca, karışıma 400 mikrolitre DMPC/telodendrimer karışımı, 15 mikrogram MOMP plazmid ve 0.6 mikrogram delta-49ApoA1 ekleyin ve karıştırın.
1.5 mililitrelik bir tüpte toplam çözeltinin 20 mikrolitresini GFP eksprese eden bir kontrol reaksiyonu için. Metiyonin içermeyen sulandırılmış amino asit karışımından 2.65 mililitre ve 300 mikrolitre sulandırılmış metiyonin ekleyerek bir besleme çözeltisi hazırlayın. Reaksiyon çözeltisinin bir mililitresini hücresiz reaksiyon kitindeki iç reaksiyon odasına aktarın ve kapatın.
Reaksiyon kabının dış haznesini 10 mililitre besleme çözeltisi ile doldurun ve kapatın. Reaksiyon karışımının 20 mikrolitrelik alikotlarına 0.5 mikrolitre GFP kontrol plazmidi ekleyin. Reaksiyonu 30 santigrat derecede 18 saat boyunca dakikada 300 devirde bir çalkalayıcıya koyun.
GFP sentezine bağlı floresan için 15 dakika sonra reaksiyonu bir UV ışığı altında izleyin. Delta-49ApoA1 proteini üzerindeki HIS-etiketini kullanarak hareketsizleştirilmiş nikel afinite kromatografisi ile MOMP-tNLP nanopartikül kompleksini hücresiz reaksiyon karışımından saflaştırın. HIS-tag saflaştırma reçinesinin% 50 bulamacının bir mililitresini 10 mililitrelik tek kullanımlık bir kromatografi kolonuna aktarın ve dengelemek için üç mililitre bağlayıcı tampon ekleyin.
Daha sonra tamponu boşaltın ve reçineye 250 mikrolitre bağlayıcı tampon ekleyin. SDS-PAGE analizi için 20 mikrolitre hücresiz reaksiyon karışımını ekstrakte edin. Kalan hücresiz reaksiyon karışımını dengelenmiş reçine ile ekleyin ve dört santigrat derecede bir saat boyunca bir laboratuvar külbütörü üzerinde inkübe edin.
Kolon kapağını çıkarın ve 500 mikrolitre bağlayıcı tamponla yıkayın. Yıkama sıvısını kolona ekleyin ve SDS-PAGE analizi için akışı toplayın. Kolonu bir mililitre yıkama tamponu ile 20 milimolar imidazol ile altı kez yıkayın ve fraksiyonları toplayın.
İkinci kez yıkarken, reçineyi çalkalamak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. MOMP-tNLP'leri, 250 milimolar imidazol içeren altı adet 300 mikrolitrelik elüsyon tamponu I fraksiyonunda ve 500 milimolar imidazol içeren 300 mikrolitre elüsyon tamponu II ile son bir elüsyonda elute edin. İkinci elüsyonda, bir mililitrelik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek reçineyi kuvvetlice çalkalayın.
Görüntüleri 600 nanometrede yakalamak için bir jel görüntüleyici kullanın. Daha sonra, bir protein standardı kullanarak SDS-PAGE analizi yoluyla nanopartiküllerdeki farklı proteinlerin miktarını ölçün. MOMP bantlarının yoğunluklarını kullanarak standart bir eğri çizin.
Ardından, nanopartiküllerin MOMP bileşenini standart ile belirleyin. Numuneleri SDS-PAGE ile çözün ve Western blot analizi için ticari bir kuru kurutma sistemi kullanarak jel yığınlarını aktarın. Lekeleri yığından çıkarın ve gece boyunca dört santigrat derecede dört santigrat derecede% 0.2 TWEEN 20 ve mililitre başına 0.5 mikrogram MAb40 veya delta-49ApoA1 proteininden HIS-etiketine karşı yönlendirilmiş mililitre başına 0.2 mikrogram MAbHIS antiHIS-tag antikoru içeren bir bloke edici tamponda inkübe edin.
Her lekeyi PBST ile yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Lekeleri, 1:10.000'lik bir seyreltmede bir florofora konjuge edilmiş ikincil antikor içeren bir bloke edici tampon içinde bir saat inkübe edin. Yıkamaları PBST ile tekrarlayın ve son yıkamadan sonra bir floresan görüntüleyici kullanarak görüntüyü yakalayın.
Bir nokta leke aparatı kullanarak, üç mikrogram MOMP-tNLP'yi ve boş tNLP'yi kurulayın. Batı lekeleme için aynı yöntemi kullanarak lekeleri geliştirin ve engelleyin. Karışık çözeltiyi kuru buz üzerinde dondurun ve bir liyofilizatör kullanarak gece boyunca liyofilize edin.
Kurutulmuş formülasyonları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Gerektiğinde, liyofilize tNLP'leri endotoksin içermeyen suyla sulandırın ve çözünmesi ve yeniden sulandırılması için yuvarlayın. Çözeltiyi PBS ile diyalize edin ve trehalozu 3.5 kilodaltonluk bir diyaliz membranı ile çıkarın.
Adjuvanı eklemeden önce nanopartikül çözeltisini bir vakum yoğunlaştırıcıda santrifüjleyin. Tam kurumayı önlemek için numune hacmini 20 ila 30 dakika sonra izleyin. Bir biyogüvenlik kabininde, adjuvanı steril koşullar altında ekleyin.
Analitik boyut dışlama kromatografisini kullanarak, başarılı bir birleştirme için formülasyonu analiz edin. Adjuvanlı MOMP-tNLP'leri ve boş tNLP'yi dört santigrat derecede 14 güne kadar saklayın. Boyut dışlama kromatografisi ile tNLP formülasyonunun stabilitesini analiz edin.
MOMP-tNLP'nin SDS-PAGE analizi, hücresiz reaksiyon karışımının hem MOMP hem de delta-49ApoA1 proteinleri için yüksek ekspresyon seviyelerine sahip olduğunu gösteren nikel afinite kromatografisi ile gerçekleştirildi. Jel dansitometrisi kullanılarak, MOMP konsantrasyonu, standart olarak bilinen bir konsantrasyona sahip saflaştırılmış bir rekombinant MOMP kullanılarak ölçüldü. Oligomer oluşumunu belirlemek için, SDS-PAGE MOMP ve MOMP-tNLP, MOMP ve delta-49ApoA1 için farklı bantlar gösteren ısı ve DTT ile muamele edildi.
MOMP proteinine karşı bir antikor MAb40 kullanılarak Western blot analizi kullanıldı ve bu, denatüre olmayan durumda MOMP proteini tarafından oligomer oluşumunu doğrulayan bir bantlama paterni ortaya çıkardı. MAb40 ve MAbHIS antikorlarının varlığında, MOMP-tNLP oluşumunu gösteren bir nokta leke testi yapıldı. Bununla birlikte, boş tNLP, MAbHIS için pozitif bir sinyal gösterdi.
Adjuvanlı MOMP-tNLP enjekte edilen aşılanmış farelerden alınan serumlar, güçlü MOMP bağlanması gösterdi ve MOMP-tNLP'nin bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarabileceğini gösterdi. Bu protokol DNA'dan protein ürettiğinden, reaksiyonun DNaz, RNaz ve ayrıca yabancı DNA ve RNA ile kontamine olmasını önlemek önemlidir. Reaksiyonlarda kullanılan herhangi bir malzeme veya reaktif bu tür moleküllerden arındırılmış olmalıdır.
Adjuvanların ekspresyonu, saflaştırılması ve eklenmesinden sonra, bu aşı adayları, immün aktivasyon belirteçlerini değerlendirmek veya bir meydan okuma sırasında korumayı değerlendirmek için ilgilenilen patojenler için uygun hayvan modellerinde değerlendirilebilir. Klamidya için, ana dış zar proteini veya MOMP, uzun yıllardır alt birim aşılar için önde gelen bir aday antijen olarak kabul edilmiştir, ancak aşı uygulaması için gerekli ölçeklerde üretilmesi zor olmuştur. Bu zar proteininin hücresiz birlikte ekspresyonu, bu proteini fareler gibi hayvan modellerinde değerlendirmeye doğru hareket ettirmeye başlamanın ve sonunda insan testine girmenin uygun bir yoludur.
