Muitos antígenos vacinais de subunidades candidatas são proteínas de membrana. Historicamente, estes têm sido difíceis de produzir e purificar em quantidades suficientes. Com essa técnica, somos capazes de criar antígenos de interesse embutidos em uma membrana lipídica para ajudar a garantir uma confirmação nativa.
Esse processo também facilita a formulação com adjuvantes de interesse. A expressão livre de células permite a produção rápida de proteínas de interesse em sua estrutura nativa sem tagless. Essa técnica também é escalável e já estamos trabalhando com empresas comerciais para o desenvolvimento de formulações de vacinas usando esse processo.
Nós demonstramos o processo aqui para um antígeno da clamídia, mas o processo poderia ser facilmente adaptado para produzir antígenos de interesse, independentemente de serem ou não proteínas de membrana. Esse processo pode ser aplicável tanto ao desenvolvimento de vacinas contra patógenos quanto contra o câncer. Para começar, prepare MOMP-tNLPs empregando um método livre de células.
Descongelar o tampão de reconstituição do kit de expressão de proteína livre de células duas horas antes de definir a reação e adicionar inibidor de protease livre de EDTA ao tampão. Use um kit projetado para executar cinco reações de um mililitro. Para cada reação de um mililitro, adicione 525 microlitros de tampão de reconstituição ao frasco de lisado de E.coli e enrole-o para dissolver.
Adicionar 250 microlitros do tampão de reconstituição ao frasco de reacção que contém o aditivo e dissolver por laminação. Em seguida, adicione 8,1 mililitros de tampão de reconstituição ao frasco de alimentação de reação e enrole-o para dissolver. Para um frasco de mistura de aminoácidos, adicione três mililitros de tampão de reconstituição para dissolvê-lo.
Para outro frasco de metionina, adicione 1,8 mililitros de tampão de reconstituição, dissolvê-lo e armazená-lo no gelo. Adicionar 225 microlitros da mistura reconstituída, 270 microlitros da mistura de aminoácidos reconstituída sem metionina e 30 microlitros de metionina reconstituída ao frasco de lisado de E.coli. Além disso, adicione 400 microlitros da mistura DMPC/telodendrímero, 15 microgramas de plasmídeo MOMP e 0,6 microgramas de delta-49ApoA1 à mistura e misture-a.
Alíquota 20 microlitros da solução total em um tubo de 1,5 mililitro Para uma reação de controle que expressa GFP. Preparar uma solução de alimentação adicionando 2,65 mililitros da mistura de aminoácidos reconstituída sem metionina e 300 microlitros de metionina reconstituída. Transfira um mililitro da solução de reação para a câmara de reação interna no kit de reação livre de células e sela-a.
Encha a câmara externa do recipiente de reação com 10 mililitros da solução de alimentação e feche-a. Adicionar 0,5 microlitros do plasmídeo de controle GFP às alíquotas de 20 microlitros da mistura de reação. Coloque a reação em um agitador a 300 rotações por minuto por 18 horas a 30 graus Celsius.
Monitorar a reação sob uma luz UV após 15 minutos para fluorescência devido à síntese de GFP. Purificar o complexo de nanopartículas MOMP-tNLP da mistura de reação livre de células por cromatografia de afinidade por níquel imobilizado usando o HIS-tag na proteína delta-49ApoA1. Transfira um mililitro da lama de 50% da resina de purificação HIS-tag para uma coluna de cromatografia descartável de 10 mililitros e adicione três mililitros de tampão de ligação para equilibrar.
Depois, escorra o tampão e adicione 250 microlitros de tampão de ligação à resina. Extrair 20 microlitros da mistura de reação livre de células para análise de SDS-PAGE. Adicione a mistura de reação livre de células restante com a resina equilibrada e incube em um balancim de laboratório por uma hora a quatro graus Celsius.
Retire a tampa da coluna e lave-a com 500 microlitros de tampão de ligação. Adicione o líquido de lavagem à coluna e colete o fluxo para análise de SDS-PAGE. Lavar a coluna com um mililitro de tampão de lavagem com imidazol 20 milimolares seis vezes e recolher as frações.
Ao lavar pela segunda vez, use uma pipeta de um mililitro para agitar a resina. Eluir os MOMP-tNLPs em seis frações de 300 microlitros de tampão de eluição I contendo imidazol 250 milimolar e uma eluição final com 300 microlitros de tampão de eluição II contendo imidazol 500 milimolar. Na segunda eluição agite vigorosamente a resina pipetando para cima e para baixo usando uma pipeta de um mililitro.
Use um imageador de gel para capturar as imagens a 600 nanômetros. Em seguida, quantificar a quantidade de diferentes proteínas nas nanopartículas através da análise de SDS-PAGE usando um padrão proteico. Desenhe uma curva padrão usando as densidades das bandas do MOMP.
Em seguida, determine o componente MOMP das nanopartículas com o padrão. Resolva as amostras por SDS-PAGE e transfira as pilhas de gel usando um sistema comercial de dry blotting para análise de Western blot. Remova as manchas da pilha e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius em um buffer de bloqueio contendo 0,2% TWEEN 20 e 0,5 microgramas por mililitro MAb40, ou 0,2 microgramas por mililitro MAbHIS anticorpo antiHIS-tag direcionado contra o HIS-tag da proteína delta-49ApoA1.
Lave cada mancha com PBST três vezes por cinco minutos por lavagem. Incubar as manchas durante uma hora num tampão de bloqueio contendo anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo numa diluição de 1:10, 000. Repita as lavagens com PBST e capture a imagem usando um imageador de fluorescência após a lavagem final.
Usando um aparelho dot blot, borre três microgramas de MOMP-tNLP e tNLP vazio. Desenvolva e bloqueie as manchas usando o mesmo método para Western blotting. Congele a solução misturada em gelo seco e liofilize-a durante a noite usando um liofilizador.
Conservar as formulações secas a menos 20 graus Celsius. Quando necessário, reconstituir as tNLPs liofilizadas com água livre de endotoxinas e enrolá-las para dissolver e reidratar. Dialisar a solução com PBS e remover a trealose com uma membrana de diálise de corte de 3,5 quilodaltons.
Centrifugar a solução de nanopartículas em um concentrador a vácuo antes de adicionar o adjuvante. Monitorar o volume da amostra após 20 a 30 minutos para evitar a secagem completa. Em um armário de biossegurança, adicione o adjuvante em condições estéreis.
Usando cromatografia analítica de exclusão de tamanho, analise a formulação para incorporação bem-sucedida. Armazene os MOMP-tNLPs adjuvantes e esvazie o tNLP a quatro graus Celsius por até 14 dias. Analisar a estabilidade da formulação de tNLP com cromatografia de exclusão de tamanho.
A análise SDS-PAGE do MOMP-tNLP foi realizada através de cromatografia de afinidade por níquel, que demonstrou que a mistura de reação livre de células tem altos níveis de expressão tanto para as proteínas MOMP quanto para as proteínas delta-49ApoA1. Empregando densitometria em gel, a concentração de MOMP foi quantificada usando um MOMP recombinante purificado com uma concentração conhecida como padrão. Para determinar a formação de oligômeros, SDS-PAGE MOMP e MOMP-tNLP foram tratados com calor e TDT, que mostraram bandas distintas para MOMP e delta-49ApoA1.
A análise de Western blot usando um anticorpo MAb40 foi empregada contra a proteína MOMP, que revelou um padrão de bandas confirmando a formação de oligômeros pela proteína MOMP em seu estado não desnaturado. Um ensaio dot blot foi realizado na presença dos anticorpos MAb40 e MAbHIS, que indicaram a formação de MOMP-tNLP. No entanto, a PNLt vazia mostrou um sinal positivo para o MAbHIS.
Soros dos camundongos imunizados injetados com MOMP-tNLP adjuvante demonstraram forte ligação ao MOMP e indicaram que MOMP-tNLP poderia provocar uma resposta imune. Uma vez que este protocolo gera proteína a partir do DNA, é essencial evitar contaminar a reação com DNase, RNase, bem como o DNA e RNA estranhos. Quaisquer materiais ou reagentes utilizados nas reações devem estar livres deste tipo de moléculas.
Após a expressão, purificação e adição de adjuvantes, essas vacinas candidatas podem ser avaliadas em modelos animais apropriados para os patógenos de interesse para avaliar marcadores de ativação imune ou avaliar a proteção durante um desafio. Para a clamídia, a principal proteína da membrana externa, ou MOMP, tem sido considerada um antígeno candidato líder para vacinas de subunidades por muitos anos, mas tem sido difícil produzir em escalas necessárias para a aplicação da vacina. A co-expressão livre de células desta proteína de membrana é uma maneira viável de começar a mover esta proteína para a avaliação em modelos animais, como os ratos, e eventualmente ir para testes em humanos.
