多くの候補サブユニットワクチン抗原は膜タンパク質です。歴史的に、これらは十分な量で製造および精製することが困難でした。この技術により、脂質膜内に埋め込まれた目的の抗原を作成し、ネイティブ様の確認を確実にすることができます。
このプロセスはまた、目的のアジュバントとの製剤化を容易にする。無細胞発現により、天然のタグレス構造で目的のタンパク質を迅速に生産することができます。この手法もスケーラブルであり、このプロセスを使用してワクチン製剤を開発するためにすでに営利企業と協力しています。
ここではクラミジア抗原のプロセスを示しますが、このプロセスは、膜タンパク質であるかどうかに関係なく、目的の抗原を生成するように簡単に適応できます。このプロセスは、病原体と癌の両方のワクチン開発に適用できる可能性があります。まず、無細胞法を用いてMOMP-tNLPを調製します。
反応をセットする2時間前に無細胞タンパク質発現キットから再構成バッファーを解凍し、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤をバッファーに添加します。1ミリリットルの反応を5回実行するように設計されたキットを使用してください。1ミリリットルの反応ごとに、525マイクロリットルの再構成バッファーを大腸菌ライセートボトルに加え、転がして溶解します。
添加剤を入れた反応瓶に250マイクロリットルの再構成バッファーを加え、転動により溶解する。次に、反応供給ボトルに8.1ミリリットルの再構成バッファーを加え、転がして溶解します。アミノ酸混合物のボトルに、それを溶解するために3ミリリットルの再構成緩衝液を加える。
メチオニンの別のボトルに、1.8ミリリットルの再構成バッファーを加えて溶解し、氷上で保管します。225マイクロリットルの再構成混合物、270マイクロリットルのメチオニンを含まない再構成アミノ酸混合物、および30マイクロリットルの再構成メチオニンを大腸菌ライセートボトルに追加します。さらに、400マイクロリットルのDMPC/テロデンドリマー混合物15マイクログラムのMOMPプラスミド、および0.6マイクログラムのデルタ-49ApoA1を混合物に加えて混合します。
全溶液の20マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに分注 GFP発現制御反応用。メチオニンを含まない2.65ミリリットルの再構成アミノ酸混合物および300マイクロリットルの再構成メチオニンを添加して飼料溶液を調製する。1ミリリットルの反応液を無細胞反応キット内の反応室に移し、密封します。
反応容器の外側のチャンバーに10ミリリットルの供給溶液を満たして閉じます。0.5マイクロリットルのGFPコントロールプラスミドを反応混合物の20マイクロリットルのアリコートに加えます。反応物をシェーカーに毎分300回転で30°Cで18時間入れる。
GFP合成による蛍光について15分後にUV光下で反応をモニターします。デルタ-49ApoA1タンパク質にHISタグを固定化したニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより、無細胞反応混合物からMOMP-tNLPナノ粒子複合体を精製します。HISタグ精製樹脂の50%スラリー1ミリリットルを10ミリリットルの使い捨てクロマトグラフィーカラムに移し、3ミリリットルの結合バッファーを加えて平衡化します。
その後、バッファーを排出し、250マイクロリットルの結合バッファーを樹脂に追加します。SDS-PAGE分析のために20マイクロリットルの無細胞反応混合物を抽出します。残りの無細胞反応混合物を平衡化樹脂とともに加え、実験室のロッカーで摂氏4度で1時間インキュベートします。
カラムキャップを取り外し、500マイクロリットルの結合バッファーで洗浄します。洗浄液をカラムに加え、SDS-PAGE分析用のフロースルーを回収します。カラムを1ミリリットルの洗浄バッファーで20ミリモルのイミダゾールで6回洗浄し、画分を収集します。
2回目の洗浄では、1ミリリットルのピペットを使用して樹脂を攪拌します。250ミリモルのイミダゾールを含む6つの300マイクロリットル画分の溶出バッファーIでMOMP-tNLPを溶出し、500ミリモルのイミダゾールを含む300マイクロリットルの溶出バッファーIIで最終溶出します。2回目の溶出では、1ミリリットルのピペットを用いて上下にピペッティングして樹脂を激しく撹拌する。
ゲルイメージャーを使用して、600ナノメートルの画像をキャプチャします。次に、タンパク質標準を用いたSDS-PAGE分析により、ナノ粒子中の異なるタンパク質の量を定量します。MOMP バンドの密度を使用して標準曲線を描画します。
次に、標準物質を用いてナノ粒子のMOMP成分を決定する。SDS-PAGEでサンプルを分離し、ウェスタンブロット分析用の市販のドライブロッティングシステムを使用してゲルスタックを転写します。ブロットをスタックから取り出し、デルタ-49ApoA1タンパク質由来のHISタグに対する0.2%TWEEN 20および0.5マイクログラム/ミリリットルのMAb40、または0.2マイクログラム/ミリリットルのMAbHIS抗HISタグ抗体を含むブロッキングバッファー中で、摂氏4度で一晩インキュベートします。
各ブロットをPBSTで3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。1:10, 000の希釈液で蛍光色素に結合した二次抗体を含むブロッキングバッファー中で、ブロットを1時間インキュベートします。PBSTで洗浄を繰り返し、最終洗浄後に蛍光イメージャーを使用して画像をキャプチャします。
ドットブロット装置を用いて、3マイクログラムのMOMP-tNLPおよび空のtNLPをブロッピングする。ウェスタンブロッティングと同じ方法を使用してブロットを開発およびブロックします。混合溶液をドライアイス上で凍結し、凍結乾燥機を使用して一晩凍結乾燥します。
乾燥した製剤をマイナス20°Cで保管してください。必要に応じて、凍結乾燥したtNLPをエンドトキシンを含まない水で再構成し、転がして溶解し、再水和します。溶液をPBSで透析し、3.5キロダルトンカットオフ透析膜でトレハロースを除去します。.
アジュバントを添加する前に、真空濃縮器でナノ粒子溶液を遠心分離します。完全に乾燥しないように、20〜30分後にサンプル量を監視してください。バイオセーフティキャビネットに、無菌条件下でアジュバントを追加します。
分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、製剤を分析して組み込みに成功させます。アジュバントしたMOMP-tNLPと空のtNLPを摂氏4度で最大14日間保管します。サイズ排除クロマトグラフィーでtNLP製剤の安定性を分析します。
MOMP-tNLPのSDS-PAGE分析はニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって行われ、無細胞反応混合物がMOMPタンパク質とデルタ-49ApoA1タンパク質の両方に対して高レベルの発現を有することを実証した。ゲルデンシトメトリーを用いて、既知濃度の精製組換えMOMPを標準物質として用いてMOMP濃度を定量した。オリゴマー形成を決定するために、SDS-PAGE MOMPおよびMOMP-tNLPを熱およびDTTで処理したところ、MOMPおよびdelta-49ApoA1に異なるバンドが示された。
MOMPタンパク質に対する抗体MAb40を用いたウェスタンブロット解析により、MOMPタンパク質による非変性状態のオリゴマー形成を確認するバンディングパターンが明らかになりました。MAb40およびMAbHIS抗体の存在下でドットブロットアッセイを実施し、MOMP-tNLPの形成を示しました。しかし、空のtNLPはMAbHISに対して陽性のシグナルを示した。
アジュバント投与されたMOMP-tNLPを注射した免疫マウスの血清は、強いMOMP結合を示し、MOMP-tNLPが免疫応答を誘発できることを示しました。このプロトコルはDNAからタンパク質を生成するため、DNase、RNase、および無関係なDNAやRNAとの反応を汚染しないようにすることが不可欠です。反応に使用される材料または試薬には、これらのタイプの分子が含まれていない必要があります。
アジュバントの発現、精製、および添加後、これらのワクチン候補を目的の病原体に適した動物モデルで評価して、免疫活性化マーカーを評価したり、チャレンジ中の防御を評価したりすることができます。クラミジアの場合、主要な外膜タンパク質(MOMP)は、長年にわたってサブユニットワクチンの主要な候補抗原と見なされてきましたが、ワクチンの適用に必要な規模で生産することは困難でした。この膜タンパク質の無細胞共発現は、このタンパク質をマウスなどの動物モデルでの評価に向けて動かし始め、最終的にはヒト試験に移行するための実行可能な方法です。
