Viele mögliche Impfstoffantigene für Untereinheiten sind Membranproteine. In der Vergangenheit war es schwierig, diese in ausreichender Menge herzustellen und zu reinigen. Mit dieser Technik sind wir in der Lage, interessante Antigene zu erzeugen, die in eine Lipidmembran eingebettet sind, um eine native Bestätigung zu gewährleisten.
Dieses Verfahren erleichtert auch die Formulierung mit interessanten Adjuvantien. Die zellfreie Expression ermöglicht die schnelle Produktion von Proteinen von Interesse in ihrer nativen taglosen Struktur. Diese Technik ist auch skalierbar und wir arbeiten bereits mit kommerziellen Unternehmen zusammen, um Impfstoffformulierungen mit diesem Verfahren zu entwickeln.
Wir demonstrieren den Prozess hier für ein Chlamydien-Antigen, aber der Prozess könnte leicht angepasst werden, um Antigene von Interesse zu produzieren, unabhängig davon, ob es sich um Membranproteine handelt oder nicht. Dieser Prozess könnte sowohl auf die Entwicklung von Krankheitserregern als auch auf die Entwicklung von Krebsimpfstoffen anwendbar sein. Bereiten Sie zunächst MOMP-tNLPs mit einer zellfreien Methode vor.
Tauen Sie den Rekonstitutionspuffer aus dem zellfreien Proteinexpressionskit zwei Stunden vor dem Einstellen der Reaktion auf und fügen Sie dem Puffer EDTA-freien Proteaseinhibitor hinzu. Verwenden Sie ein Kit, das für fünf Ein-Milliliter-Reaktionen ausgelegt ist. Für jede Ein-Milliliter-Reaktion werden 525 Mikroliter Rekonstitutionspuffer in die E.coli-Lysatflasche gegeben und gerollt, um sie aufzulösen.
250 Mikroliter des Rekonstitutionspuffers in die Reaktionsflasche mit dem Additiv geben und durch Rollen auflösen. Als nächstes werden 8,1 Milliliter Rekonstitutionspuffer in die Reaktionsflasche gegeben und zum Auflösen gerollt. Fügen Sie einer Flasche mit einer Aminosäuremischung drei Milliliter Rekonstitutionspuffer hinzu, um sie aufzulösen.
Zu einer weiteren Flasche Methionin geben Sie 1,8 Milliliter Rekonstitutionspuffer, lösen Sie ihn auf und lagern Sie ihn auf Eis. 225 Mikroliter der rekonstituierten Mischung, 270 Mikroliter der rekonstituierten Aminosäuremischung ohne Methionin und 30 Mikroliter rekonstituiertes Methionin in die E.coli-Lysatflasche geben. Des Weiteren werden 400 Mikroliter der DMPC/Telodendrimer-Mischung, 15 Mikrogramm MOMP-Plasmid und 0,6 Mikrogramm Delta-49ApoA1 zu der Mischung gegeben und gemischt.
Aliquot 20 Mikroliter der Gesamtlösung in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen Für eine GFP-exprimierende Kontrollreaktion. Bereiten Sie eine Futterlösung vor, indem Sie 2,65 Milliliter der rekonstituierten Aminosäuremischung ohne Methionin und 300 Mikroliter rekonstituiertes Methionin hinzufügen. Einen Milliliter der Reaktionslösung in die innere Reaktionskammer des zellfreien Reaktionskits überführen und verschließen.
Füllen Sie die äußere Kammer des Reaktionsgefäßes mit 10 Millilitern der Zufuhrlösung und verschließen Sie sie. Zu den 20-Mikroliter-Aliquoten des Reaktionsgemisches werden 0,5 Mikroliter des GFP-Kontrollplasmids gegeben. Die Reaktion wird 18 Stunden lang bei 30 Grad Celsius mit 300 Umdrehungen pro Minute in einen Shaker gegeben.
Überwachen Sie die Reaktion unter UV-Licht nach 15 Minuten auf Fluoreszenz aufgrund der GFP-Synthese. Reinigen Sie den MOMP-tNLP-Nanopartikelkomplex aus dem zellfreien Reaktionsgemisch durch immobilisierte Nickelaffinitätschromatographie unter Verwendung des HIS-Tags auf dem Delta-49ApoA1-Protein. Geben Sie einen Milliliter der 50%igen Aufschlämmung des HIS-Tag-Reinigungsharzes in eine 10-Milliliter-Einweg-Chromatographiesäule und fügen Sie drei Milliliter Bindungspuffer hinzu, um das Gleichgewicht herzustellen.
Danach den Puffer abtropfen lassen und dem Harz 250 Mikroliter Bindepuffer hinzufügen. Extrahieren Sie 20 Mikroliter der zellfreien Reaktionsmischung für die SDS-PAGE-Analyse. Die restliche zellfreie Reaktionsmischung mit dem äquilibrierten Harz zugeben und eine Stunde auf einer Laborwippe bei vier Grad Celsius inkubieren.
Entfernen Sie die Säulenkappe und waschen Sie sie mit 500 Mikrolitern Bindepuffer. Geben Sie die Waschflüssigkeit in die Säule und sammeln Sie den Durchfluss für die SDS-PAGE-Analyse. Waschen Sie die Säule sechsmal mit einem Milliliter Waschpuffer mit 20-Millimolar-Imidazol und sammeln Sie die Fraktionen.
Verwenden Sie beim zweiten Waschen eine Ein-Milliliter-Pipette, um das Harz zu rühren. Die MOMP-tNLPs werden in sechs 300-Mikroliter-Fraktionen des Elutionspuffers I mit 250-Millimolar-Imidazol und einer endgültigen Elution mit 300 Mikrolitern Elutionspuffer II mit 500-Millimolar-Imidazol eluiert. Bei der zweiten Elution wird das Harz kräftig gerührt, indem Sie es mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren.
Verwenden Sie einen Gel-Imager, um die Bilder bei 600 Nanometern aufzunehmen. Quantifizieren Sie dann die Menge der verschiedenen Proteine in den Nanopartikeln durch SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung eines Proteinstandards. Zeichnen Sie eine Standardkurve mit den Dichten der MOMP-Bänder.
Bestimmen Sie dann die MOMP-Komponente der Nanopartikel mit dem Standard. Lösen Sie die Proben mit SDS-PAGE auf und übertragen Sie die Gelstapel mit einem handelsüblichen Trockenblotting-System für die Western-Blot-Analyse. Entfernen Sie die Blots aus dem Stapel und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem Blockierungspuffer, der 0,2 % TWEEN 20 und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter MAb40 oder 0,2 Mikrogramm pro Milliliter MAbHIS-AntiHIS-Tag-Antikörper enthält, der gegen den HIS-Tag des Delta-49ApoA1-Proteins gerichtet ist.
Waschen Sie jeden Klecks dreimal für fünf Minuten pro Waschgang mit PBST. Inkubieren Sie die Blots für eine Stunde in einem Blockierungspuffer, der sekundäre Antikörper enthält, die mit einem Fluorophor in einer Verdünnung von 1:10.000 konjugiert sind. Wiederholen Sie die Wäschen mit PBST und nehmen Sie das Bild nach der letzten Wäsche mit einem Fluoreszenz-Imager auf.
Tupfen Sie mit einem Dot-Blot-Gerät drei Mikrogramm MOMP-tNLP und entleeren Sie tNLP. Entwickeln und blockieren Sie die Blots mit der gleichen Methode wie beim Western Blotting. Die gemischte Lösung auf Trockeneis einfrieren und über Nacht mit einem Gefriertrockner gefrieren.
Lagern Sie die getrockneten Rezepturen bei minus 20 Grad Celsius. Rekonstituieren Sie bei Bedarf die gefriergetrockneten tNLPs mit endotoxinfreiem Wasser und rollen Sie es, um es aufzulösen und zu rehydrieren. Dialysieren Sie die Lösung mit PBS und entfernen Sie die Trehalose mit einer 3,5-Kilodalton-Cutoff-Dialysemembran.
Zentrifugieren Sie die Nanopartikellösung in einem Vakuumkonzentrator, bevor Sie das Adjuvans hinzufügen. Überwachen Sie das Probenvolumen nach 20 bis 30 Minuten, um ein vollständiges Austrocknen zu verhindern. Geben Sie das Adjuvans in einer Biosicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen hinzu.
Analysieren Sie die Formulierung mit Hilfe der analytischen Größenausschlusschromatographie für eine erfolgreiche Einarbeitung. Lagern Sie die adjuvantierten MOMP-tNLPs und entleeren Sie tNLP bei vier Grad Celsius für bis zu 14 Tage. Analysieren Sie die Stabilität der tNLP-Formulierung mit Größenausschlusschromatographie.
Die SDS-PAGE-Analyse von MOMP-tNLP wurde mittels Nickel-Affinitätschromatographie durchgeführt, die zeigte, dass das zellfreie Reaktionsgemisch sowohl für das MOMP- als auch für das delta-49ApoA1-Protein eine hohe Expression aufweist. Mit Hilfe der Geldensitometrie wurde die MOMP-Konzentration unter Verwendung eines gereinigten rekombinanten MOMP mit einer bekannten Konzentration als Standard quantifiziert. Um die Oligomerbildung zu bestimmen, wurden SDS-PAGE MOMP und MOMP-tNLP mit Hitze und DTT behandelt, die unterschiedliche Banden für MOMP und delta-49ApoA1 aufwiesen.
Die Western-Blot-Analyse mit dem Antikörper MAb40 wurde gegen das MOMP-Protein durchgeführt, was ein Bandenmuster zeigte, das die Oligomerbildung durch das MOMP-Protein in seinem nicht denaturierten Zustand bestätigte. In Gegenwart von MAb40- und MAbHIS-Antikörpern wurde ein Dot-Blot-Assay durchgeführt, der auf die Bildung von MOMP-tNLP hindeutete. Leeres tNLP zeigte jedoch ein positives Signal für MAbHIS.
Seren von immunisierten Mäusen, denen adjuvantiertes MOMP-tNLP injiziert wurde, zeigten eine starke MOMP-Bindung und deuteten darauf hin, dass MOMP-tNLP eine Immunantwort hervorrufen könnte. Da dieses Protokoll Protein aus DNA erzeugt, ist es wichtig, eine Kontamination der Reaktion mit DNase, RNase sowie der fremden DNA und RNA zu vermeiden. Alle Materialien oder Reagenzien, die in den Reaktionen verwendet werden, sollten frei von dieser Art von Molekülen sein.
Nach der Expression, Reinigung und Zugabe von Adjuvantien können diese Impfstoffkandidaten in geeigneten Tiermodellen für die interessierenden Krankheitserreger evaluiert werden, um Immunaktivierungsmarker zu bewerten oder den Schutz während einer Herausforderung zu bewerten. Für Chlamydien gilt das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) seit vielen Jahren als führender Kandidat für Subunit-Impfstoffe, aber es war schwierig, es in den für die Impfstoffanwendung erforderlichen Maßstäben herzustellen. Die zellfreie Co-Expression dieses Membranproteins ist ein gangbarer Weg, um dieses Protein in Tiermodellen wie Mäusen zu evaluieren und schließlich am Menschen zu testen.
