많은 후보 서브유닛 백신 항원은 막 단백질이다. 역사적으로 이들은 충분한 양을 생산하고 정제하기가 어려웠습니다. 이 기술을 통해 우리는 지질막에 내장된 관심 항원을 생성하여 네이티브와 같은 확인을 보장할 수 있습니다.
이 공정은 또한 관심 보조제와의 제형을 용이하게 합니다. 무세포 발현은 태그가 없는 천연 구조에서 관심 단백질의 신속한 생산을 가능하게 합니다. 이 기술은 또한 확장 가능하며 우리는 이미 이 프로세스를 사용하여 백신 제형을 개발하기 위해 상업 회사와 협력하고 있습니다.
우리는 여기에서 클라미디아 항원에 대한 과정을 보여주지만, 이 과정은 막 단백질인지 여부에 관계없이 관심 항원을 생성하도록 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 과정은 병원체 및 암 백신 개발 모두에 적용될 수 있습니다. 시작하려면 cell-free 방법을 사용하여 MOMP-tNLP를 준비합니다.
반응을 설정하기 2시간 전에 cell-free 단백질 발현 키트에서 재구성 완충액을 해동하고 EDTA-free 프로테아제 억제제를 완충액에 첨가합니다. 5개의 1밀리리터 반응을 실행하도록 설계된 키트를 사용하십시오. 각 1밀리리터 반응에 대해 525마이크로리터의 재구성 완충액을 대장균 용해물 병에 넣고 굴려 용해시킵니다.
250 마이크로리터의 재구성 완충액을 첨가제가 들어 있는 반응 병에 첨가하고 롤링하여 용해시킨다. 다음으로, 8.1 밀리리터의 재구성 완충액을 반응 공급 병에 첨가하고 롤링하여 용해시킨다. 아미노산 혼합물 한 병에 3 밀리리터의 재구성 완충액을 첨가하여 용해시킵니다.
메티오닌의 다른 병에, 재구성 완충액의 1.8 밀리리터를 추가, 그것을 녹인, 얼음에 보관하십시오. 225 마이크로리터의 재구성된 혼합물, 270 마이크로리터의 메티오닌이 없는 재구성된 아미노산 혼합물, 및 30 마이크로리터의 재구성된 메티오닌을 대장균 용해물 병에 첨가한다. 또한, 400 마이크로리터의 DMPC/텔로덴드리머 혼합물, 15 마이크로그램의 MOMP 플라스미드 및 0.6 마이크로그램의 델타-49ApoA1을 혼합물에 첨가하고 혼합한다.
1.5 밀리리터 튜브에 총 용액의 20 마이크로리터를 분취하여 GFP 발현 조절 반응을 일으켰다. 메티오닌이 없는 재구성된 아미노산 혼합물 2.65 밀리리터 및 재구성된 메티오닌 300 마이크로리터를 첨가하여 사료 용액을 제조한다. 반응 용액 1밀리리터를 cell-free 반응 키트 내의 내부 반응 챔버로 옮기고 밀봉한다.
반응 용기의 외부 챔버를 10 밀리리터의 공급 용액으로 채우고 닫으십시오. 0.5 마이크로리터의 GFP 대조군 플라스미드를 반응 혼합물의 20 마이크로리터 분취량에 첨가한다. 반응물을 섭씨 30도에서 18시간 동안 분당 300회 회전하는 진탕기에 넣습니다.
GFP 합성에 의한 형광에 대해 15분 후에 UV 광 하에서 반응을 모니터링한다. delta-49ApoA1 단백질에 HIS-tag를 이용하여 고정화된 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 cell-free 반응 혼합물로부터 MOMP-tNLP 나노입자 복합체를 정제한다. HIS-tag 정제 수지의 50% 슬러리 1밀리리터를 10밀리리터 일회용 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 3밀리리터의 결합 완충액을 추가하여 평형을 이룹니다.
그런 다음 버퍼를 배출하고 250마이크로리터의 결합 버퍼를 수지에 추가합니다. SDS-PAGE 분석을 위해 무세포 반응 혼합물 20 마이크로리터를 추출한다. 나머지 무세포 반응 혼합물을 평형화된 수지와 함께 첨가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 실험실 로커에서 배양합니다.
컬럼 캡을 제거하고 500마이크로리터의 결합 완충액으로 세척합니다. 세척액을 컬럼에 추가하고 SDS-PAGE 분석을 위해 플로우 스루를 수집합니다. 1 밀리리터의 세척 완충액으로 컬럼을 20-밀리몰 이미다졸로 6회 세척하고 분획을 수집한다.
두 번째로 세척하는 동안 1 밀리리터 피펫을 사용하여 수지를 교반하십시오. 250밀리몰 이미다졸을 함유하는 용출 완충액 I의 300마이크로리터 분획 6개에서 MOMP-tNLP를 용리하고, 500밀리몰 이미다졸을 함유하는 용출 완충액 II 300마이크로리터로 최종 용출한다. 두 번째 용출 시, 1밀리리터 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 수지를 세게 교반합니다.
젤 이미저를 사용하여 600나노미터에서 이미지를 캡처합니다. 그 후, 단백질 표준물질을 이용한 SDS-PAGE 분석을 통해 나노입자 내의 다양한 단백질의 양을 정량한다. MOMP 밴드의 밀도를 사용하여 표준 곡선을 그립니다.
그 후, 나노입자의 MOMP 성분을 표준물질로 확인한다. SDS-PAGE로 샘플을 분리하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 상업용 건식 블로팅 시스템을 사용하여 겔 스택을 옮깁니다. 스택에서 블롯을 제거하고 0.2% TWEEN 20 및 밀리리터 MAb40당 0.5마이크로그램 또는 델타-49ApoA1 단백질의 HIS-태그에 대한 MAbHIS 항HIS-태그 항체를 포함하는 차단 완충액에서 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.
세척 당 5분 동안 PBST로 각 블롯을 3회 세척합니다. 1:10, 000의 희석으로 형광단에 접합된 2차 항체를 함유하는 블로킹 완충액에서 1시간 동안 블롯을 인큐베이션한다. PBST로 세척을 반복하고 최종 세척 후 형광 이미저를 사용하여 이미지를 캡처합니다.
도트 블롯 장치를 이용하여, 3 마이크로그램의 MOMP-tNLP와 빈 tNLP를 블롯한다. 웨스턴 블로팅과 동일한 방법을 사용하여 블롯을 개발하고 차단합니다. 혼합 용액을 드라이아이스에 동결하고 동결건조기를 사용하여 밤새 동결건조한다.
건조된 제형을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 필요한 경우 동결건조된 tNLP를 내독소가 없는 물로 재구성하고 롤링하여 용해 및 재수화합니다. PBS로 용액을 투석하고 3.5-kilodalton-cutoff 투석막으로 트레할로스를 제거한다.
보조제를 첨가하기 전에 진공 농축기에서 나노 입자 용액을 원심분리합니다. 완전한 건조를 방지하기 위해 20-30분 후에 샘플 부피를 모니터링합니다. 생물 안전 캐비닛에 무균 상태에서 보조제를 추가하십시오.
분석 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 성공적인 통합을 위해 제형을 분석합니다. 보조제가 있는 MOMP-tNLP와 빈 tNLP를 섭씨 4도에서 최대 14일 동안 보관하십시오. 크기 배제 크로마토그래피로 tNLP 제형의 안정성을 분석합니다.
MOMP-tNLP의 SDS-PAGE 분석은 니켈 친화성 크로마토그래피를 통해 수행되었으며, 이는 무세포 반응 혼합물이 MOMP 및 delta-49ApoA1 단백질 모두에 대해 높은 수준의 발현을 갖는다는 것을 입증했습니다. 겔 밀도 측정법을 이용하여, 공지된 농도를 표준으로 하는 정제된 재조합 MOMP를 사용하여 MOMP 농도를 정량화하였다. 올리고머 형성을 결정하기 위해, SDS-PAGE MOMP 및 MOMP-tNLP를 열 및 DTT로 처리하였고, 이는 MOMP 및 delta-49ApoA1에 대해 뚜렷한 밴드를 나타내었다.
항체 MAb40을 사용한 웨스턴 블롯 분석을 MOMP 단백질에 대해 사용하였고, 이는 비변성 상태에서 MOMP 단백질에 의한 올리고머 형성을 확인하는 밴딩 패턴을 밝혀냈다. MAb40 및 MAbHIS 항체의 존재 하에서 도트 블롯 분석을 수행하였고, 이는 MOMP-tNLP의 형성을 지시하였다. 그러나 빈 tNLP는 MAbHIS에 대해 긍정적인 신호를 나타냈습니다.
보조제 MOMP-tNLP를 주사한 면역화된 마우스의 혈청은 강력한 MOMP 결합을 입증했으며 MOMP-tNLP가 면역 반응을 유도할 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 DNA에서 단백질을 생성하기 때문에 DNase, RNase, 외부 DNA 및 RNA와의 반응을 오염시키지 않는 것이 중요합니다. 반응에 사용되는 모든 재료 또는 시약에는 이러한 유형의 분자가 없어야 합니다.
보조제의 발현, 정제 및 첨가 후, 이러한 백신 후보는 면역 활성화 마커를 평가하거나 챌린지 동안 보호를 평가하기 위해 관심 병원체에 대한 적절한 동물 모델에서 평가될 수 있습니다. 클라미디아의 경우 주요 외막 단백질(MOMP)이 수년 동안 서브유닛 백신의 주요 후보 항원으로 여겨져 왔지만 백신 적용에 필요한 규모로 생산하기가 어려웠습니다. 이 막 단백질의 무세포 공동 발현은 이 단백질을 생쥐와 같은 동물 모델에서 평가하기 시작하고 결국 인간 실험에 들어갈 수 있는 실행 가능한 방법입니다.
