使用PCR板深孔微孔设备生成更大的细菌生物膜生物质

该程序的目标是通过结晶紫染色和抗菌药敏试验，将标准钉盖生物膜装置与聚丙烯深井生物膜装置进行比较。标准钉盖生物膜设备具有96个钉子，并安装在标准96孔微量滴定板的顶部，允许进行高通量生物膜实验。钉子盖为生物膜生长提供了表面，可以在下游实验中进一步分析在钉子上生长的生物膜。

然而，这些板使用的最大体积为200微升，使得使用需要更多生物膜的实验来研究生物膜的形成和生物质更具挑战性。在这里，我们描述了用于生长静态生物膜的深井生物膜装置。深孔生物膜装置利用96孔深孔微量滴定板，该板配有半裙边96孔PCR板作为销盖。

这种方法允许的最大板体积为750微升，为生物膜生长提供更多的固定表面积，并且与标准生物膜设备相比成本更低。我们将描述和比较生物膜的结晶紫染色方案，以确定生物膜生物质，以及确定最小生物膜根除浓度，也称为MBEC。图中显示了将要描述的实验的示意图。

将冷冻保存的储备中的所需细菌菌株直接记录到营养琼脂平板上。在最佳菌株条件下孵育琼脂平板过夜。第二天，在五毫升生长培养基中接种单个菌落，并在培养箱中生长培养物过夜。

生物膜板将如图所示填充。用750微升无菌水填充外孔，用750微升无菌生长培养基填充阴性对照井。用675微升无菌生长培养基填充剩余的孔。

将过夜培养物标准化为600纳米1.0的光密度。创建一个十倍稀释系列，直到达到10到负3稀释。接种培养基孔，将10至负3个稀释培养物用于10至负4的最终细菌稀释和750微升的最终总孔内体积。

小心地将销盖插入生物膜板。在最佳应变条件下孵育板，最大振荡速度为160 RPM，持续24小时。小心地从生物膜生长板上取下钉盖，并在每孔充满800微升无菌PBS的新深孔板中冲洗生物膜。

将钉盖转移到每孔含有800微升（体积为0.1%体积晶体紫）的新型深孔板中，并染色五分钟。在装满PBS的新鲜深孔板中再次冲洗盖子，以去除多余的污渍。在生物安全柜中让盖子干燥10分钟后，将钉子在充满每孔800微升30%苦行僧酸的深孔板中脱色5分钟。

取下销盖并彻底混合，以均匀分布污渍。将200微升从深孔生物膜设备转移到标准的96孔微量滴定板中，并读取550纳米处的光密度。抗菌激发板将如图所示制备。

用750微升无菌水填充外孔，用750微升生长培养基填充阳性和阴性对照井。用750微升所需的抗菌稀释系列填充剩余的孔。小心地从设备上取下钉盖，并在每孔PBS含量为800微升的无菌深孔板中冲洗。

将销盖转移到抗菌激发板中，并孵育所需的暴露时间范围。无菌地从抗菌暴露板上取下钉盖，然后在无菌深孔PBS填充的板中冲洗。从PBS上取下钉盖，转移到每孔含有750微升回收介质的新深孔板中。

在超声处理水浴中对板进行超声处理30分钟。取下固定盖，更换为标准非钉式平顶微量滴定板盖，以避免污染。在最佳应变条件下孵育过夜。

第二天，将200微升从深孔板转移到标准微量滴定板，并读取600纳米处的光密度。结晶紫染色是一种有效且广泛使用的近似细菌生物膜生物量的方法。标准和深井装置的结晶紫染色表明，与标准装置相比，两种细菌物种在深井装置上生长的生物量显着增加，大肠杆菌形成的生物量比标准生物膜装置多2.1倍，铜绿假单胞菌形成4.1倍的生物量。

这些结果与我们的假设一致，即深井生物膜装置增加的表面积将允许增加生物量积累。尽管在深井设备上生长的两种菌株的技术复制CV染色值的变异性更大，但使用成对双向方差分析或P值大于0.05的学生T检验，没有注意到任何物种的生物重复的统计学显着差异。这一发现表明，深井装置形成的生物膜形成类似于标准装置的可重复生物膜。

在标准化生物膜生物质后，我们的结果表明，在标准和深井设备之间的体积和固定表面积方面，确实表明所测试的两种细菌物种之间存在轻微但显着的材料偏好。在聚丙烯深井装置上，铜绿假单胞菌的生物量形成相对增加1.4倍，大肠杆菌的生物量形成相对减少1.52倍，在聚苯乙烯标准装置上观察到相反的影响。细菌物种对生物膜装置钉材料的偏好差异表明，结果无法在生物膜装置之间进行交叉比较。

使用季铵化合物苯扎氯铵测试了24小时生物膜的抗菌挑战，苯扎氯铵已知是细菌生物膜形成的有效抑制剂，但对于生物膜根除的抗菌剂效果较差。我们的结果表明，与标准生物膜装置的生长相比，从深井生物膜装置获得的BZK BMEC值对于大肠杆菌平均增加了六倍，对于铜绿假单胞菌增加了八倍。BZK MBEC结果如预期的那样变化更大，因为它是一种用于生物膜根除的不太有效的抗菌剂，并且由于几个异常值的生物膜钉在较高浓度下存活，因此两种设备上的大肠杆菌MBEC值范围更大。

我们还比较了消毒剂漂白剂，众所周知，这是一种非常有效的抗菌剂，可以根除细菌生物膜。与深井装置相比，漂白剂在标准装置中测试时表现出略高MBEC值，导致大肠杆菌分别增加四倍和铜绿假单胞菌增加两倍。然而，这些差异在设备之间可重复误差的范围内，并且表现出比BZK少得多的变异性，证实了漂白剂是用于生物膜根除的更有效的抗菌剂。

每个生物膜装置的一个主要限制是钉子的不同塑料组成以及由此产生的不同细菌物种对这些表面的粘附和生物质形成的可变性。此外，在执行所述方案之前，必须考虑不同抗菌剂与塑料钉材料之间的化学相互作用和相容性。总之，该协议和我们对深井和标准生物膜装置的生物质比较结果表明，两者都能够培养健壮的大肠杆菌和铜绿假单胞菌生物膜，深井装置提供比标准装置更多的每钉表面积生物量。

深井生物膜设备为静态、高通量生物膜培养和筛选研究提供了一种可行、经济实惠的替代方案，这些研究需要大量生物膜进行下游分析。由于每个设备之间的塑料材料成分不同，CV染色的生物膜生物量和MBEC值不能直接在设备之间进行比较。然而，如果在同一设备上持续进行实验，则分离株和抗菌剂之间获得的结果具有可比性。

对于希望使用低成本材料在高通量测定中研究生物膜的实验室，建议使用深井生物膜设备。