L'obiettivo di questa procedura è quello di confrontare il dispositivo di biofilm standard del coperchio del piolo con un dispositivo di biofilm profondo del polipropilene attraverso la colorazione viola cristallina e i test di suscettibilità antimicrobica. Un dispositivo di biofilm con coperchio a piolo standard ha 96 pioli e si adatta a una piastra di microtitolazione standard a 96 pozzetti che consente esperimenti di biofilm ad alta produttività. Il coperchio del piolo fornisce una superficie per la crescita del biofilm e i biofilm cresciuti sui pioli possono essere ulteriormente analizzati in esperimenti a valle.
Tuttavia, le piastre utilizzano un volume massimo di 200 microlitri rendendo più difficile studiare la formazione di biofilm e la biomassa utilizzando esperimenti che richiedono maggiori quantità di biofilm. Qui, descriviamo il dispositivo di biofilm profondo per la coltivazione di biofilm statici. Il dispositivo di biofilm del pozzo profondo utilizza una piastra microtitolatrice profonda 96 pozzi dotata di una piastra PCR semi-gonna a 96 pozzetti come coperchio del piolo.
Questo metodo consente un volume massimo della piastra di 750 microlitri, fornisce una maggiore superficie di peg per la crescita del biofilm ed è più economico rispetto al dispositivo biofilm standard. Descriveremo e confronteremo i protocolli per la colorazione viola cristallina dei biofilm per determinare la biomassa del biofilm, nonché la determinazione della concentrazione minima di eradicazione del biofilm, nota anche come MBEC. Viene mostrata una panoramica schematica dell'esperimento che verrà descritta.
Striscia i ceppi batterici desiderati da un brodo crioconservato direttamente su una piastra di agar nutriente. Incubare le piastre di agar durante la notte con condizioni di deformazione ottimali. Il giorno seguente, inoculare una singola colonia in cinque millilitri di terreni di crescita e coltivare colture in un'incubatrice durante la notte.
Le lastre del biofilm saranno riempite come mostrato. Riempire i pozzetti esterni con 750 microlitri di acqua sterile e pozzi di controllo negativo con 750 microlitri di mezzi di crescita sterili. Riempire i pozzi rimanenti con 675 microlitri di terreni di crescita sterili.
Standardizzare le colture notturne a una densità ottica a 600 nanometri di 1,0. Create una serie di diluizione di dieci volte fino a raggiungere una diluizione da 10 a meno tre. Inoculare i pozzetti dei mezzi con la coltura diluita da 10 a meno tre per una diluizione batterica finale da 10 a meno quattro e il volume totale finale in pozzo di 750 microlitri.
Inserire con attenzione il coperchio del piolo nella piastra del biofilm. Incubare le piastre in condizioni di deformazione ottimali con scuotimento massimo di 160 RPM per 24 ore. Rimuovere con attenzione il coperchio del piolo dalla piastra di crescita del biofilm e risciacquare i biofilm in una nuova piastra profonda riempita con 800 microlitri di PBS sterile per pozzetto.
Trasferire i coperchi del piolo in una nuova piastra di pozzo profondo contenente 800 microlitri per pozzetto dello 0,1% di peso in volume cristallo viola e lasciare macchiare per cinque minuti. Risciacquare nuovamente i coperchi in una piastra fresca e profonda riempita con PBS per rimuovere le macchie in eccesso. Dopo aver lasciato asciugare i coperchi per 10 minuti in un armadietto di biosicurezza, rimuovere i pioli in una piastra di pozzo profondo riempita con 800 microlitri di acido ascetico al 30% per pozzetto per cinque minuti.
Rimuovere il coperchio del piolo e mescolare accuratamente per distribuire uniformemente la macchia. Trasferire 200 microlitri dal dispositivo di biofilm del pozzo profondo in una piastra di microtitolazione standard a 96 pozzetti e leggere la densità ottica a 550 nanometri. Le piastre di sfida antimicrobica saranno preparate come mostrato.
Riempire i pozzi esterni con 750 microlitri di acqua sterile e i pozzi di controllo positivi e negativi con 750 microlitri di mezzi di crescita. Riempire i pozzetti rimanenti con 750 microlitri della serie di diluizione antimicrobica desiderata. Rimuovere con cura il coperchio del piolo dal dispositivo e risciacquare in una piastra sterile profonda con 800 microlitri per pozzetto di PBS.
Trasferire il coperchio del piolo nella piastra di sfida antimicrobica e incubare per il periodo di esposizione desiderato. Rimuovere asetticamente i coperchi dei pioli dalla piastra di esposizione antimicrobica e risciacquare in una piastra sterile riempita di PBS con pozzetto profondo. Rimuovere il coperchio del piolo dal PBS e trasferirlo in una nuova piastra di pozzo profondo contenente 750 microlitri di mezzi di recupero per pozzetto.
Sonicare la piastra in un bagno d'acqua sonicante per 30 minuti. Rimuovere il coperchio del piolo e sostituirlo con un coperchio standard a piastra di microtitolazione piatta non ancorato per evitare contaminazioni. Incubare in condizioni di deformazione ottimali durante la notte.
Il giorno seguente, trasferire 200 microlitri dalla piastra del pozzo profondo a una piastra di microtitolazione standard e leggere la densità ottica a 600 nanometri. La colorazione viola cristallina è un metodo efficace e ampiamente utilizzato per approssimare la biomassa dei biofilm batterici. La colorazione viola cristallina dei dispositivi standard e profondi ha mostrato che entrambe le specie batteriche hanno sviluppato significativamente più biomassa sul dispositivo del pozzo profondo rispetto al dispositivo standard con Escherichia coli che forma 2,1 volte più biomassa rispetto al dispositivo biofilm standard e Pseudomonas aeruginosa che forma 4,1 volte più biomassa.
Questi risultati erano coerenti con la nostra ipotesi che l'aumento della superficie del dispositivo di biofilm del pozzo profondo avrebbe permesso un maggiore accumulo di biomassa. Nonostante una maggiore variabilità nei valori tecnici di replicazione CV per entrambi i ceppi che crescono sul dispositivo del pozzo profondo, non sono state notate differenze statisticamente significative per le repliche biologiche di entrambe le specie utilizzando ANOVA bidirezionale a coppie o T-test dello studente con valori P superiori a 0,05. Questa scoperta mostra che la formazione di biofilm da parte di dispositivi a pozzo profondo forma biofilm riproducibili simili a quelli dei dispositivi standard.
I nostri risultati dopo aver standardizzato la biomassa del biofilm per il volume e l'area della superficie del piolo tra i dispositivi standard e profondi del pozzo hanno indicato una leggera ma significativa preferenza materiale tra le due specie batteriche testate. Sul dispositivo del pozzo profondo in polipropilene, Pseudomonas aeruginosa ha dimostrato un aumento relativo di 1,4 volte della formazione di biomassa e Escherichia coli ha dimostrato una diminuzione relativa di 1,52 volte della formazione di biomassa con l'effetto inverso osservato sul dispositivo standard di polistirene. Questa differenza nella preferenza delle specie batteriche per il materiale peg del dispositivo biofilm indica che i risultati non possono essere confrontati tra i dispositivi biofilm.
La sfida antimicrobica dei biofilm di 24 ore è stata testata utilizzando il composto di ammonio quaternario benzalconio cloruro che è noto per essere un inibitore efficace della formazione di biofilm batterico, ma un antimicrobico meno efficace per l'eradicazione del biofilm. I nostri risultati hanno mostrato che i valori BZK BMEC ottenuti dal dispositivo di biofilm del pozzo profondo sono aumentati in media di sei volte per Escherichia coli e di otto volte per Pseudomonas aeruginosa rispetto alla crescita sul dispositivo biofilm standard. I risultati di BZK MBEC sono stati più variabili come previsto poiché è un antimicrobico meno efficace per l'eradicazione del biofilm e ha portato a un intervallo per i valori MBEC di Escherichia coli su entrambi i dispositivi a causa di un paio di picchetti di biofilm anomali che sono sopravvissuti a concentrazioni più elevate.
Abbiamo anche confrontato la candeggina disinfettante, che è nota per essere un antimicrobico molto efficace per l'eradicazione del biofilm batterico. Bleach ha dimostrato un valore MBEC leggermente più alto quando testato nel dispositivo standard rispetto al dispositivo a pozzo profondo per entrambe le specie, portando ad un aumento di quattro volte di Escherichia coli e un aumento di due volte di Pseudomonas aeruginosa rispettivamente. Tuttavia, queste differenze rientravano nell'intervallo di errore riproducibile tra i dispositivi e dimostravano una variabilità molto inferiore rispetto a BZK, confermando la candeggina come un antimicrobico più efficace per l'eradicazione del biofilm.
Una delle principali limitazioni di ciascun dispositivo biofilm sarebbe la diversa composizione plastica dei pioli e la conseguente variabilità nell'aderenza e nella formazione di biomassa di diverse specie batteriche a queste superfici. Inoltre, le interazioni chimiche e le compatibilità tra i diversi antimicrobici e il materiale plastico del piolo devono essere prese in considerazione prima di eseguire il protocollo descritto. In conclusione, questo protocollo e i risultati dei nostri confronti di biomassa sul pozzo profondo e sui dispositivi di biofilm standard mostrano che entrambi sono in grado di coltivare robusti biofilm di Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa con il dispositivo del pozzo profondo che fornisce significativamente più biomassa per superficie del piolo rispetto al dispositivo standard.
Il dispositivo per biofilm a pozzo profondo offre un'alternativa praticabile e conveniente per studi di coltivazione e screening di biofilm statici e ad alta produttività che richiedono maggiori quantità di biofilm per l'analisi a valle. A causa delle differenze nelle composizioni di materiale plastico tra ciascun dispositivo, la biomassa del biofilm macchiata CV e i valori MBEC non possono essere confrontati direttamente tra i dispositivi. Tuttavia, se gli esperimenti sono condotti in modo coerente sullo stesso dispositivo, i risultati ottenuti tra isolati e antimicrobici sono comparabili.
Il dispositivo di biofilm per pozzi profondi è consigliato per i laboratori che desiderano studiare biofilm in saggi ad alta produttività utilizzando materiali a basso costo.
