L’objectif de cette procédure est de comparer le dispositif de biofilm à couvercle de cheville standard à un dispositif de biofilm de puits profond en polypropylène par coloration violette cristalline et tests de sensibilité aux antimicrobiens. Un dispositif de biofilm à couvercle de cheville standard a 96 chevilles et s’adapte sur une plaque de microtitrage standard de 96 puits permettant des expériences de biofilm à haut débit. Le couvercle de la cheville fournit une surface pour la croissance du biofilm et les biofilms cultivés sur les chevilles peuvent être analysés plus en détail dans des expériences en aval.
Cependant, les plaques utilisent un volume maximal de 200 microlitres, ce qui rend plus difficile l’étude de la formation de biofilm et de la biomasse à l’aide d’expériences qui exigent de plus grandes quantités de biofilm. Ici, nous décrivons le dispositif de biofilm de puits profond pour la culture de biofilms statiques. Le dispositif de biofilm de puits profond utilise une plaque de microtitrage de puits de 96 puits de profondeur équipée d’une plaque de PCR semi-jupe de 96 puits comme couvercle de cheville.
Cette méthode permet d’obtenir un volume de plaque maximal de 750 microlitres, fournit plus de surface de cheville pour la croissance du biofilm et est moins coûteuse que le dispositif de biofilm standard. Nous décrirons et comparerons les protocoles de coloration violette cristalline des biofilms pour déterminer la biomasse du biofilm, ainsi que la détermination de la concentration minimale d’éradication du biofilm, également connue sous le nom de MBEC. Vous trouverez un aperçu schématique de l’expérience qui sera décrite.
Striez les souches bactériennes souhaitées d’un bouillon cryoconservé directement sur une plaque de gélose nutritive. Incuber des plaques de gélose pendant la nuit dans des conditions de contrainte optimales. Le lendemain, inoculez une seule colonie dans cinq millilitres de milieux de croissance et cultivez des cultures dans un incubateur pendant la nuit.
Les plaques de biofilm seront remplies comme indiqué. Remplissez les puits extérieurs avec 750 microlitres d’eau stérile et les puits de contrôle négatif avec 750 microlitres de milieux de croissance stériles. Remplissez les puits restants avec 675 microlitres de milieux de croissance stériles.
Normaliser les cultures pendant la nuit à une densité optique de 600 nanomètres de 1,0. Créez une série de dilution décuplée jusqu’à ce qu’une dilution de 10 à moins trois soit atteinte. Puits de milieu inoculés avec la culture diluée de 10 à moins trois pour une dilution bactérienne finale de 10 à moins quatre et le volume total final dans le puits de 750 microlitres.
Insérez soigneusement le couvercle de la cheville dans la plaque de biofilm. Incuber des plaques dans des conditions de déformation optimales avec une secousse maximale de 160 tr / min pendant 24 heures. Retirez soigneusement le couvercle de la cheville de la plaque de croissance du biofilm et rincez les biofilms dans une nouvelle plaque de puits profond remplie de 800 microlitres de PBS stérile par puits.
Transférer les couvercles de cheville dans une nouvelle plaque de puits profonde contenant 800 microlitres par puits de 0,1% de poids par volume cristal violet et laisser tacher pendant cinq minutes. Rincez à nouveau les couvercles dans une plaque de puits fraîche et profonde remplie de PBS pour éliminer l’excès de tache. Après avoir laissé sécher les couvercles pendant 10 minutes dans une armoire de biosécurité, détachez les chevilles dans une plaque de puits profonde remplie de 800 microlitres d’acide ascétique à 30% par puits pendant cinq minutes.
Retirez le couvercle de la cheville et mélangez bien pour répartir uniformément la tache. Transférez 200 microlitres du dispositif de biofilm de puits profond dans une plaque de microtitrage standard de 96 puits et lisez la densité optique à 550 nanomètres. Les plaques de provocation antimicrobienne seront préparées comme indiqué.
Remplissez les puits extérieurs avec 750 microlitres d’eau stérile et les puits de contrôle positif et négatif avec 750 microlitres de milieux de croissance. Remplissez les puits restants avec 750 microlitres de la série de dilution antimicrobienne souhaitée. Retirez soigneusement le couvercle de la cheville de l’appareil et rincez dans une plaque de puits profonde stérile avec 800 microlitres par puits de PBS.
Transférer le couvercle de la cheville sur la plaque de provocation antimicrobienne et incuber pendant la période d’exposition souhaitée. Retirer de manière aseptique les couvercles de cheville de la plaque d’exposition aux antimicrobiens et rincer dans une plaque stérile remplie de PBS profondément. Retirez le couvercle de la cheville du PBS et transférez-le dans une nouvelle plaque de puits profond contenant 750 microlitres de milieu de récupération par puits.
Sonicer la plaque dans un bain-marie sonique pendant 30 minutes. Retirez le couvercle de la cheville et remplacez-le par un couvercle de plaque de microtitrage plat standard non attaché pour éviter toute contamination. Incuber dans des conditions de déformation optimales pendant la nuit.
Le lendemain, transférez 200 microlitres de la plaque de puits profond vers une plaque de microtitrage standard et lisez la densité optique à 600 nanomètres. La coloration violette cristalline est une méthode efficace et largement utilisée pour approximer la biomasse des biofilms bactériens. La coloration violette cristalline des dispositifs de puits standard et profonds a montré que les deux espèces bactériennes produisaient beaucoup plus de biomasse sur le dispositif de puits profond par rapport au dispositif standard, Escherichia coli formant 2,1 fois plus de biomasse par rapport au dispositif de biofilm standard et Pseudomonas aeruginosa formant 4,1 fois plus de biomasse.
Ces résultats concordaient avec notre hypothèse selon laquelle l’augmentation de la surface du dispositif de biofilm de puits profond permettrait une accumulation accrue de biomasse. Malgré une plus grande variabilité dans les valeurs techniques de réplication des gènes pour les deux souches poussant sur le dispositif de puits profond, aucune différence statistiquement significative pour les répliques biologiques de l’une ou l’autre espèce n’a été notée en utilisant l’ANOVA bidirectionnelle par paires ou le test T de l’étudiant avec des valeurs P supérieures à 0,05. Cette découverte montre que la formation de biofilm par les dispositifs de puits profonds forme des biofilms reproductibles similaires à ceux des dispositifs standard.
Nos résultats après avoir normalisé la biomasse du biofilm pour le volume et la surface du piquet entre les dispositifs de puits standard et profonds ont indiqué une préférence de matériau légère mais significative entre les deux espèces bactériennes testées. Sur le dispositif de puits profond en polypropylène, Pseudomonas aeruginosa a démontré une augmentation relative de 1,4 fois de la formation de biomasse et Escherichia coli a démontré une diminution relative de 1,52 fois de la formation de biomasse avec l’effet inverse observé sur le dispositif standard en polystyrène. Cette différence dans la préférence des espèces bactériennes pour le matériau de cheville de dispositif de biofilm indique que les résultats ne peuvent pas être comparés entre les dispositifs de biofilm.
Le défi antimicrobien des biofilms de 24 heures a été testé en utilisant le composé d’ammonium quaternaire chlorure de benzalkonium qui est connu pour être un inhibiteur efficace de la formation de biofilm bactérien, mais un antimicrobien moins efficace pour l’éradication du biofilm. Nos résultats ont montré que les valeurs BZK BMEC obtenues à partir du dispositif de biofilm de puits profond ont été multipliées par six en moyenne pour Escherichia coli et par huit pour Pseudomonas aeruginosa par rapport à la croissance sur le dispositif de biofilm standard. Les résultats de BZK MBEC étaient plus variables que prévu, car il s’agit d’un antimicrobien moins efficace pour l’éradication du biofilm et ont entraîné une fourchette des valeurs de MBEC d’Escherichia coli sur les deux dispositifs en raison de quelques chevilles de biofilm aberrantes qui ont survécu à des concentrations plus élevées.
Nous avons également comparé l’eau de Javel désinfectante, qui est connue pour être un antimicrobien très efficace pour l’éradication du biofilm bactérien. L’eau de Javel a démontré une valeur MBEC légèrement supérieure lorsqu’elle a été testée dans le dispositif standard par rapport au dispositif de puits profond pour les deux espèces, ce qui a entraîné une multiplication par quatre d’Escherichia coli et une multiplication par deux de Pseudomonas aeruginosa respectivement. Cependant, ces différences se situaient dans la gamme d’erreurs reproductibles entre les dispositifs et ont démontré beaucoup moins de variabilité que le BZK, confirmant que l’eau de Javel était un antimicrobien plus efficace pour l’éradication du biofilm.
Une limitation majeure de chaque dispositif de biofilm serait la composition plastique différente des chevilles et la variabilité qui en résulte dans l’adhérence et la formation de biomasse de différentes espèces bactériennes à ces surfaces. De plus, les interactions chimiques et les compatibilités entre les différents antimicrobiens et le matériau de cheville en plastique doivent être prises en compte avant d’exécuter le protocole décrit. En conclusion, ce protocole et les résultats de nos comparaisons de biomasse sur les puits profonds et les dispositifs de biofilm standard montrent que les deux sont capables de cultiver des biofilms robustes d’Escherichia coli et de Pseudomonas aeruginosa avec le dispositif de puits profond fournissant beaucoup plus de biomasse par surface de piquet que le dispositif standard.
Le dispositif de biofilm de puits profonds offre une alternative viable et abordable pour la culture statique et à haut débit de biofilm et les études de criblage qui nécessitent de plus grandes quantités de biofilm pour l’analyse en aval. En raison des différences de composition des matières plastiques entre chaque dispositif, les valeurs de biomasse de biofilm teintée CV et de MBEC ne peuvent pas être directement comparées entre les dispositifs. Cependant, si les expériences sont systématiquement menées sur le même dispositif, les résultats obtenus entre les isolats et les antimicrobiens sont comparables.
Le dispositif de biofilm de puits profond est recommandé pour les laboratoires qui souhaitent étudier les biofilms dans des essais à haut débit utilisant des matériaux à faible coût.
