Ziel dieses Verfahrens ist es, das Standard-Peg-Deckel-Biofilmgerät durch kristallviolette Färbung und antimikrobielle Suszeptibilitätstests mit einem Polypropylen-Tiefbrunnen-Biofilmgerät zu vergleichen. Ein Standard-Peg-Deckel-Biofilmgerät verfügt über 96 Stifte und passt auf eine Standard-Mikrotiterplatte mit 96 Wells, die Biofilmexperimente mit hohem Durchsatz ermöglicht. Der Peg-Deckel bietet eine Oberfläche für das Biofilmwachstum und Biofilme, die auf den Pegs gezüchtet werden, können in nachgeschalteten Experimenten weiter analysiert werden.
Die Platten verwenden jedoch ein maximales Volumen von 200 Mikrolitern, was es schwieriger macht, die Biofilmbildung und Biomasse mit Experimenten zu untersuchen, die größere Mengen an Biofilm erfordern. Hier beschreiben wir das Tiefbrunnen-Biofilmgerät zum Züchten statischer Biofilme. Das Tiefbrunnen-Biofilmgerät verwendet eine 96-Well-Tiefbrunnen-Mikrotiterplatte, die mit einer halbseitigen 96-Well-PCR-Platte als Peg-Deckel ausgestattet ist.
Diese Methode ermöglicht ein maximales Plattenvolumen von 750 Mikrolitern, bietet mehr Peg-Oberfläche für das Biofilmwachstum und ist im Vergleich zum Standard-Biofilmgerät kostengünstiger. Wir werden die Protokolle für die kristallviolette Färbung von Biofilmen beschreiben und vergleichen, um die Biofilmbiomasse zu bestimmen, sowie die Bestimmung der minimalen Biofilmeradikationskonzentration, auch bekannt als MBEC. Gezeigt wird eine schematische Übersicht über das Experiment, das beschrieben wird.
Streichen Sie gewünschte Bakterienstämme aus einer kryokonservierten Brühe direkt auf eine Nährstoff-Agar-Platte. Agarplatten über Nacht mit optimalen Dehnungsbedingungen inkubieren. Am nächsten Tag eine einzelne Kolonie in fünf Millilitern Wachstumsmedien impfen und über Nacht Kulturen in einem Inkubator anbauen.
Die Biofilmplatten werden wie gezeigt gefüllt. Füllen Sie die äußeren Brunnen mit 750 Mikrolitern sterilem Wasser und die Negativkontrollbrunnen mit 750 Mikrolitern sterilen Wachstumsmedien. Füllen Sie die restlichen Vertiefungen mit 675 Mikrolitern steriler Wachstumsmedien.
Standardisieren Sie Übernachtkulturen auf eine optische Dichte bei 600 Nanometern von 1,0. Erstellen Sie eine zehnfache Verdünnungsreihe, bis eine Verdünnung von 10 bis minus drei erreicht ist. Beimpfen Sie Medienvertiefungen mit der 10 bis minus drei verdünnten Kultur für eine endgültige bakterielle Verdünnung von 10 auf minus vier und ein endgültiges Gesamtin-Well-Volumen von 750 Mikrolitern.
Setzen Sie den Stiftdeckel vorsichtig in die Biofilmplatte ein. Inkubieren Sie Platten unter optimalen Dehnungsbedingungen mit maximalem Schütteln von 160 U / min für 24 Stunden. Entfernen Sie vorsichtig den Stiftdeckel von der Biofilm-Wachstumsplatte und spülen Sie die Biofilme in eine neue Tiefbrunnenplatte, die mit 800 Mikrolitern sterilem PBS pro Vertiefung gefüllt ist.
Übertragen Sie die Peg-Deckel auf eine neue Tiefbrunnenplatte, die 800 Mikroliter pro Vertiefung von 0,1% Volumengewicht Kristallviolett enthält, und lassen Sie sie fünf Minuten lang flecken. Spülen Sie die Deckel erneut in einer frischen, mit PBS gefüllten Tiefbrunnenplatte ab, um überschüssige Flecken zu entfernen. Nachdem Sie die Deckel in einer Biosicherheitskabine 10 Minuten trocknen ließen, beflecken Sie die Heringe fünf Minuten lang in einer tiefen Brunnenplatte, die mit 800 Mikrolitern 30% Asketensäure pro Vertiefung gefüllt ist.
Entfernen Sie den Stiftdeckel und mischen Sie ihn gründlich, um den Fleck gleichmäßig zu verteilen. Übertragen Sie 200 Mikroliter aus dem Tiefbrunnen-Biofilmgerät in eine Standard-96-Well-Mikrotiterplatte und lesen Sie die optische Dichte bei 550 Nanometern ab. Die antimikrobiellen Challenge-Platten werden wie gezeigt vorbereitet.
Füllen Sie die äußeren Brunnen mit 750 Mikrolitern sterilem Wasser und die positiven und negativen Kontrollbrunnen mit 750 Mikrolitern Wachstumsmedien. Füllen Sie die verbleibenden Vertiefungen mit 750 Mikrolitern der gewünschten antimikrobiellen Verdünnungsreihe. Entfernen Sie vorsichtig den Stiftdeckel vom Gerät und spülen Sie ihn in einer sterilen Tiefbrunnenplatte mit 800 Mikrolitern PBS pro Vertiefung ab.
Übertragen Sie den Stiftdeckel auf die antimikrobielle Challenge-Platte und inkubieren Sie für den gewünschten Belichtungszeitraum. Entfernen Sie aseptisch die Stiftdeckel von der antimikrobiellen Expositionsplatte und spülen Sie sie in einer sterilen, mit PBS gefüllten Tiefkühlplatte ab. Entfernen Sie den Peg-Deckel vom PBS und geben Sie ihn in eine neue Tieflochplatte mit 750 Mikrolitern Rückgewinnungsmedien pro Bohrloch.
Beschallen Sie die Platte in einem beschallenden Wasserbad für 30 Minuten. Entfernen Sie den Stiftdeckel und ersetzen Sie ihn durch einen standardmäßigen, nicht gebundenen flachen Mikrotiterplattendeckel, um eine Kontamination zu vermeiden. Inkubieren Sie bei optimalen Dehnungsbedingungen über Nacht.
Am folgenden Tag übertragen Sie 200 Mikroliter von der Tiefbrunnenplatte auf eine Standard-Mikrotiterplatte und lesen die optische Dichte bei 600 Nanometern ab. Die Kristallviolettfärbung ist eine effektive und weit verbreitete Methode zur Annäherung an die Biomasse bakterieller Biofilme. Die kristallviolette Färbung der Standard- und Tiefbrunnengeräte zeigte, dass beide Bakterienarten im Vergleich zum Standardgerät signifikant mehr Biomasse auf dem Tiefbrunnengerät anbauten, wobei Escherichia coli im Vergleich zum Standard-Biofilmgerät 2,1-mal mehr Biomasse bildete und Pseudomonas aeruginosa 4,1-mal mehr Biomasse bildete.
Diese Ergebnisse stimmten mit unserer Hypothese überein, dass die vergrößerte Oberfläche des Tiefbrunnen-Biofilmgeräts eine erhöhte Biomasseakkumulation ermöglichen würde. Trotz größerer Variabilität bei den technisch replizierten CV-gefärbten Werten für beide Stämme, die auf dem Tiefbrunnengerät wachsen, wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede für die biologischen Replikate beider Arten festgestellt, wobei paarweise bidirektionale ANOVA oder der T-Test des Schülers mit P-Werten größer als 0,05 waren. Dieser Befund zeigt, dass die Biofilmbildung durch Tiefbrunnengeräte reproduzierbare Biofilme ähnlich denen von Standardgeräten bildet.
Unsere Ergebnisse nach der Standardisierung der Biofilmbiomasse für Volumen und Peg-Oberfläche zwischen den Standard- und Tiefbrunnengeräten deuteten auf eine leichte, aber signifikante Materialpräferenz zwischen den beiden getesteten Bakterienarten hin. Auf dem Polypropylen-Tiefbrunnengerät zeigte Pseudomonas aeruginosa einen 1,4-fachen relativen Anstieg der Biomassebildung und Escherichia coli zeigte eine 1,52-fache relative Abnahme der Biomassebildung mit dem inversen Effekt, der auf dem Polystyrol-Standardgerät beobachtet wurde. Dieser Unterschied in der Bakterienartenpräferenz für Biofilm-Peg-Material deutet darauf hin, dass die Ergebnisse nicht zwischen Biofilm-Geräten verglichen werden können.
Die antimikrobielle Herausforderung von 24-Stunden-Biofilmen wurde mit der quartären Ammoniumverbindung Benzalkoniumchlorid getestet, von der bekannt ist, dass sie ein wirksamer Inhibitor der bakteriellen Biofilmbildung ist, aber ein weniger wirksames antimikrobielles Mittel zur Ausrottung von Biofilmen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die BZK-BMEC-Werte, die aus dem Tiefbrunnen-Biofilmgerät gewonnen wurden, für Escherichia coli um das Sechsfache und für Pseudomonas aeruginosa um das Achtfache im Vergleich zum Wachstum auf dem Standard-Biofilmgerät stiegen. Die BZK MBEC-Ergebnisse waren als erwartet variabler, da es sich um ein weniger wirksames antimikrobielles Mittel zur Biofilmausrottung handelt, und führten zu einer Bandbreite für Escherichia coli MBEC-Werte auf beiden Geräten aufgrund einiger Ausreißer-Biofilm-Pegs, die bei höheren Konzentrationen überlebten.
Wir haben auch das Desinfektionsmittel Bleichmittel verglichen, von dem bekannt ist, dass es ein sehr wirksames antimikrobielles Mittel zur Ausrottung bakterieller Biofilme ist. Bleichmittel zeigte einen etwas höheren MBEC-Wert, wenn es im Standardgerät im Vergleich zum Tiefbrunnengerät für beide Arten getestet wurde, was zu einem vierfachen Anstieg von Escherichia coli bzw. einem zweifachen Anstieg von Pseudomonas aeruginosa führte. Diese Unterschiede lagen jedoch im Bereich des reproduzierbaren Fehlers zwischen den Geräten und zeigten eine viel geringere Variabilität als BZK, was Bleichmittel als wirksameres antimikrobielles Mittel zur Ausrottung von Biofilmen bestätigt.
Eine wesentliche Einschränkung jedes Biofilmgeräts wäre die unterschiedliche plastische Zusammensetzung der Heringe und die daraus resultierende Variabilität in der Haftung und Biomassebildung verschiedener Bakterienarten an diesen Oberflächen. Darüber hinaus müssen chemische Wechselwirkungen und Kompatibilitäten zwischen verschiedenen antimikrobiellen Mitteln und dem Kunststoff-Peg-Material berücksichtigt werden, bevor das beschriebene Protokoll durchgeführt wird. Zusammenfassend zeigen dieses Protokoll und die Ergebnisse unserer Biomassevergleiche an den Tiefbrunnen- und Standard-Biofilmgeräten, dass beide in der Lage sind, robuste Escherichia coli- und Pseudomonas aeruginosa-Biofilme zu kultivieren, wobei das Tiefbrunnengerät deutlich mehr Biomasse pro Peg-Oberfläche liefert als das Standardgerät.
Das Tiefbrunnen-Biofilmgerät bietet eine praktikable, erschwingliche Alternative für statische Biofilmkultivierungs- und Screening-Studien mit hohem Durchsatz, die größere Mengen an Biofilm für die nachgelagerte Analyse erfordern. Aufgrund der Unterschiede in der Kunststoffmaterialzusammensetzung zwischen den einzelnen Geräten können die CV-gefärbten Biofilm-Biomasse- und MBEC-Werte nicht direkt zwischen den Geräten verglichen werden. Wenn jedoch Experimente konsistent mit demselben Gerät durchgeführt werden, sind die zwischen Isolaten und antimikrobiellen Mitteln erzielten Ergebnisse vergleichbar.
Das Tiefbrunnen-Biofilmgerät wird für Labore empfohlen, die Biofilme in Hochdurchsatz-Assays mit kostengünstigen Materialien untersuchen möchten.
