El objetivo de este procedimiento es comparar el dispositivo de biopelícula de tapa de clavija estándar con un dispositivo de biopelícula de pozo profundo de polipropileno a través de la tinción de violeta cristalina y las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana. Un dispositivo de biopelícula de tapa de clavija estándar tiene 96 clavijas y se ajusta a una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos, lo que permite experimentos de biopelícula de alto rendimiento. La tapa de la clavija proporciona una superficie para el crecimiento de la biopelícula y las biopelículas cultivadas en las clavijas se pueden analizar más a fondo en experimentos posteriores.
Sin embargo, las placas utilizan un volumen máximo de 200 microlitros, lo que hace que sea más difícil estudiar la formación de biopelículas y la biomasa utilizando experimentos que exigen mayores cantidades de biopelícula. Aquí, describimos el dispositivo de biopelícula de pozo profundo para el cultivo de biopelículas estáticas. El dispositivo de biopelícula de pozo profundo utiliza una placa de microtitulación de pozo profundo de 96 pocillos equipada con una placa de PCR semifaldada de 96 pocillos como tapa de clavija.
Este método permite un volumen máximo de placa de 750 microlitros, proporciona más área de superficie de clavija para el crecimiento de biopelículas y es de menor costo en comparación con el dispositivo de biopelícula estándar. Describiremos y compararemos los protocolos para la tinción violeta cristalina de biopelículas para determinar la biomasa de biopelículas, así como la determinación de la concentración mínima de erradicación de biopelículas, también conocida como MBEC. Se muestra una descripción general esquemática del experimento que se describirá.
Streak deseaba cepas bacterianas de un caldo criopreservado directamente sobre un plato de agar nutritivo. Incubar placas de agar durante la noche con condiciones de deformación óptimas. Al día siguiente, inocular una sola colonia en cinco mililitros de medios de crecimiento y cultivar cultivos en una incubadora durante la noche.
Las placas de biofilm se llenarán como se muestra. Llene los pozos exteriores con 750 microlitros de agua estéril y los pozos de control negativo con 750 microlitros de medios de crecimiento estériles. Llene los pozos restantes con 675 microlitros de medios de crecimiento estériles.
Estandarice los cultivos nocturnos a una densidad óptica a 600 nanómetros de 1.0. Cree una serie de dilución de diez veces hasta que se alcance una dilución de 10 a menos tres. Inocular los pocillos de medios con el cultivo diluido de 10 a menos tres para una dilución bacteriana final de 10 a menos cuatro y un volumen total final en el pozo de 750 microlitros.
Inserte con cuidado la tapa de la clavija en la placa de biopelícula. Incubar placas en condiciones óptimas de deformación con agitación máxima de 160 RPM durante 24 horas. Retire cuidadosamente la tapa de la clavija de la placa de crecimiento de la biopelícula y enjuague las biopelículas en una nueva placa de pozo profundo llena de 800 microlitros de PBS estéril por pozo.
Transfiera las tapas de la clavija a una nueva placa de pozo profundo que contenga 800 microlitros por pocillo de 0.1% de peso por volumen de cristal violeta y deje manchar durante cinco minutos. Enjuague las tapas nuevamente en una placa fresca y profunda llena de PBS para eliminar el exceso de manchas. Después de dejar que las tapas se sequen durante 10 minutos en un gabinete de bioseguridad, desasténga las clavijas en una placa de pozo profunda llena de 800 microlitros de ácido ascético al 30% por pozo durante cinco minutos.
Retire la tapa de la clavija y mezcle bien para distribuir uniformemente la mancha. Transfiera 200 microlitros desde el dispositivo de biopelícula de pozo profundo a una placa de microtitulación estándar de 96 pocillos y lea la densidad óptica a 550 nanómetros. Las placas de desafío antimicrobiano se prepararán como se muestra.
Llene los pozos exteriores con 750 microlitros de agua estéril y los pozos de control positivo y negativo con 750 microlitros de medios de crecimiento. Llene los pocillos restantes con 750 microlitros de la serie de dilución antimicrobiana deseada. Retire con cuidado la tapa de la clavija del dispositivo y enjuague en una placa de pozo profundo estéril con 800 microlitros por pocillo de PBS.
Transfiera la tapa de la clavija a la placa de desafío antimicrobiano e incube durante el período de exposición deseado. Retire asépticamente las tapas de clavijas de la placa de exposición antimicrobiana y enjuague en una placa estéril llena de PBS de pozo profundo. Retire la tapa de la clavija del PBS y transfiérala a una nueva placa de pozo profundo que contenga 750 microlitros de medios de recuperación por pozo.
Sonicar la placa en un baño de agua sonicante durante 30 minutos. Retire la tapa de la clavija y reemplácela con una tapa estándar de placa de microtitulación plana no fijada para evitar la contaminación. Incubar en condiciones óptimas de deformación durante la noche.
Al día siguiente, transfiera 200 microlitros de la placa del pozo profundo a una placa de microtitulación estándar y lea la densidad óptica a 600 nanómetros. La tinción violeta cristalina es un método eficaz y ampliamente utilizado para aproximar la biomasa de biopelículas bacterianas. La tinción violeta cristalina de los dispositivos de pozo estándar y profundo mostró que ambas especies bacterianas crecieron significativamente más biomasa en el dispositivo de pozo profundo en comparación con el dispositivo estándar con Escherichia coli formando 2.1 veces más biomasa en comparación con el dispositivo de biopelícula estándar y Pseudomonas aeruginosa formando 4.1 veces más biomasa.
Estos resultados fueron consistentes con nuestra hipótesis de que el aumento de la superficie del dispositivo de biopelícula del pozo profundo permitiría una mayor acumulación de biomasa. A pesar de la mayor variabilidad en los valores técnicos de reproducción técnica teñidas con CV para ambas cepas que crecen en el dispositivo de pozo profundo, no se observaron diferencias estadísticamente significativas para las réplicas biológicas de ninguna de las especies utilizando ANOVA bidireccional por pares o la prueba T de Student con valores de P superiores a 0,05. Este hallazgo muestra que la formación de biopelículas por dispositivos de pozos profundos forma biopelículas reproducibles similares a las de los dispositivos estándar.
Nuestros resultados después de estandarizar la biomasa de biopelícula para el volumen y el área de superficie de clavija entre los dispositivos de pozo estándar y profundo indicaron una ligera pero significativa preferencia material entre las dos especies bacterianas probadas. En el dispositivo de pozo profundo de polipropileno, Pseudomonas aeruginosa demostró un aumento relativo de 1,4 veces en la formación de biomasa y Escherichia coli demostró una disminución relativa de 1,52 veces en la formación de biomasa con el efecto inverso observado en el dispositivo estándar de poliestireno. Esta diferencia en la preferencia de las especies bacterianas por el material peg del dispositivo de biopelícula indica que los resultados no se pueden comparar entre dispositivos de biopelícula.
El desafío antimicrobiano de biopelículas de 24 horas se probó utilizando el compuesto de amonio cuaternario cloruro de benzalconio, que se sabe que es un inhibidor efectivo de la formación de biopelículas bacterianas, pero un antimicrobiano menos efectivo para la erradicación de biopelículas. Nuestros resultados mostraron que los valores de BZK BMEC obtenidos del dispositivo de biopelícula de pozo profundo aumentaron en un promedio de seis veces para Escherichia coli y ocho veces para Pseudomonas aeruginosa en comparación con el crecimiento en el dispositivo de biopelícula estándar. Los resultados de BZK MBEC fueron más variables como se esperaba, ya que es un antimicrobiano menos efectivo para la erradicación de biopelículas y dio como resultado un rango para los valores de MBEC de Escherichia coli en ambos dispositivos debido a un par de clavijas de biopelícula atípicas que sobrevivieron a concentraciones más altas.
También comparamos el blanqueador desinfectante, que se sabe que es un antimicrobiano muy efectivo para la erradicación de biopelículas bacterianas. Bleach demostró un valor de MBEC ligeramente más alto cuando se probó en el dispositivo estándar en comparación con el dispositivo de pozo profundo para ambas especies, lo que llevó a un aumento de cuatro veces en Escherichia coli y un aumento de dos veces en Pseudomonas aeruginosa respectivamente. Sin embargo, estas diferencias estaban dentro del rango de error reproducible entre dispositivos y demostraron mucha menos variabilidad que BZK, confirmando que el blanqueador es un antimicrobiano más efectivo para la erradicación de biopelículas.
Una limitación importante de cada dispositivo de biopelícula sería la diferente composición plástica de las clavijas y la variabilidad resultante en la adherencia y la formación de biomasa de diferentes especies bacterianas a estas superficies. Además, las interacciones químicas y las compatibilidades entre los diferentes antimicrobianos y el material plástico de la clavija deben tenerse en cuenta antes de realizar el protocolo descrito. En conclusión, este protocolo y los hallazgos de nuestras comparaciones de biomasa en el pozo profundo y los dispositivos de biopelícula estándar muestran que ambos son capaces de cultivar biopelículas robustas de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa con el dispositivo de pozo profundo que proporciona significativamente más biomasa por área de superficie de clavija que el dispositivo estándar.
El dispositivo de biopelícula de pozo profundo ofrece una alternativa viable y asequible para el cultivo de biopelículas estáticas de alto rendimiento y los estudios de cribado que requieren mayores cantidades de biopelícula para el análisis posterior. Debido a las diferencias en las composiciones de materiales plásticos entre cada dispositivo, los valores de biomasa de biopelícula teñida con CV y MBEC no se pueden comparar directamente entre dispositivos. Sin embargo, si los experimentos se realizan consistentemente en el mismo dispositivo, los resultados obtenidos entre aislados y antimicrobianos son comparables.
El dispositivo de biopelícula de pozo profundo se recomienda para laboratorios que deseen estudiar biopelículas en ensayos de alto rendimiento utilizando materiales de bajo costo.
