Этот протокол позволяет нам создать сложную 3D-структуру, которая очень напоминает развивающееся человеческое сердце простым экономически эффективным способом, который воспроизводится по клеточным линиям. Он состоит из единого протокола с тремя ступенями дифференцировки, который дает начало всем типам клеток сердца, включая камеры и сосудистую сеть. Этот метод позволяет моделировать широкий спектр сердечно-сосудистых заболеваний человека и проводить скрининг эффективных фармакологических методов лечения.
Благодаря высокой пропускной способности его конструкция. Этот метод полезен для исследования развивающегося сердца человека, а также заболеваний, обычно связанных с ним. Одним из них являются врожденные пороки сердца.
Этот протокол требует базовых навыков клеточной культуры. Мы рекомендуем внимательное и деликатное пипетирование, а также бережное обращение с органоидами. Начните с создания эмбриоидных тел или ЭБ за два дня до дифференцировки.
Мойте субсовмещенные ГЭСК с DBPS не менее 10 секунд. Затем аспирируйте DPBS. Добавьте один миллилитр ACUTA комнатной температуры и осторожно постукивайте по пластине примерно пять раз в минуту в течение трех-пяти минут, чтобы вызвать отслоение, проверяя под микроскопом.
Затем добавьте один миллилитр среды PSC и Thias Avin или Thias, чтобы остановить реакцию. Пипетка среды вверх и вниз в лунке, два-три раза, чтобы сгенерировать одноклеточную суспензию и собрать клетки. Затем перенесут одноклеточную суспензию в трубку центрифуги и вращают в течение пяти минут в 300 раз больше G.Аспирируйте супернатант и повторно расходуйте клетки в одном миллилитре среды PSC и Thias.
Разбавляют клетки в DPBS. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток или гемоцистометра и разбавьте клетки в среде PSC с Thias до концентрации 100 000 клеток на миллилитр. Добавьте 100 микролитров суспензии разбавленных клеток в каждую лунку круглого дна сверхнизкой пластины крепления 96 лунок.
Центрифугируйте пластину в 100 раз G в течение трех минут и инкубируйте в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа аккуратно удалите 50 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 200 стержневых подстилок свежей среды PSC, прогретой до 37 градусов Цельсия на объем 250 микролитров на лунку. Инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Удалите 166 микролитров или две трети среды с одной стороны каждой лунки и добавьте 166 микролитров RPMI 1640, содержащих добавку B27 без инсулина, шесть микромоляров чир-990211, 0,875 нанограмма на миллилитр костного морфогенетического белка четыре и 1,5 нанограмма на миллилитр активина A.Инкубата в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Через 24 часа удалите 166 микролитров среды с одной стороны каждой лунки и добавьте 166 микролитров свежего RPMI 1640 с добавкой B27 без инсулина. Инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Чтобы вызвать спецификацию сердечной мезодермы на второй день, удалите 166 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 166 микролитров RPMI 1640, содержащих инсулиновую добавку B27 и три микромоляра Wnt-C59 и продолжайте инкубацию в течение 48 часов. На четвертый день удалите 166 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 166 микролитров свежего RPMI 1640 с добавкой B27 без инсулина, затем инкубируйте еще 48 часов. На шестой день удалите 166 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 166 микролитров RPMI 1640 с добавкой B27.
Для этого и всех последующих изменений сред используйте добавку В27 с инсулином, инкубируйте еще 24 часа. На седьмой день клеточная культура готова к проэпикардиальной дифференцировке. Удалите 166 микролитров среды из каждой лунки и добавьте 166 микролитров свежего RPMI 1640, содержащего добавку B27 и три микромолярия cheer 99021.
Затем в инкубации в течение одного часа, через час извлекают пластину из инкубатора, удаляют 166 микролитров среды с одной стороны каждой лунки и добавляют 166 микролитров свежего RPMI 1640, содержащего добавку B27, продолжают инкубацию еще 48 часов. Повторяйте этот процесс каждые 48 часов до сбора. Органоиды готовы к анализам и экспериментам на 15-й день Чтобы перенести целые органоиды, вырежьте кончик пипетки P200, от пяти до 10 миллиметров от отверстия диаметром примерно два-три миллиметра.
Прижмите плунжер пипетки и вставьте наконечник вертикально в круглое дно вместе с органоидом. Возьмите примерно от 100 до 200 микролитров среды, достаточной для сбора органоидов и передачи их к целевому месту назначения. До того, как дифференциация ЭБШ появляется в виде сферических масс черных, процесс дифференцировки начинается на нулевой день с активацией пути Wnt и добавлением фактора роста ровно в течение 24 часов.
Дальнейшее редактирование Wnt C59 на второй день приводит к увеличению органоида примерно с 200 микрометров до максимум одного миллиметра. Органоиды человеческого сердца начали биться уже на шестой день, и 100% органоидов показали видимое биение к 10-му дню. Изображения с высоким увеличением органоида седьмого дня показали, что большинство экспрессирующих клеток одной руки были кардиомиоцитарными по происхождению, а вторая рука была немиозитовыми клетками из второго Heartfield, клеток-предшественников.
Транскрипты РНК для обеих рук первой и второй руки экспрессировались с третьего дня в данных секвенирования РНК. Маркеры FHF были высоко выражены в течение третьего и 11-го дней, в то время как маркер SF был более выражен после 13-го дня. Иммунофлуоресцентное пятно выявило наличие различных линий клеток сердца человека, которые составляют сердце человека.
Такие как ткань миокарда и эпикарда, клетки эндокарда, эндотелиальные клетки и фибробласты сердца. Маркеры, экспрессирующие вышеуказанные клеточные линии, также наблюдались в профилях экспрессии генов РНК SAC. Живая кальциевая визуализация отдельных клеток в целых органоидах использовалась для измерения электрофизиологической функции органоидов.
Интенсивность флуоресценции Флуо-4 изменялась с течением времени из-за выхода кальция из клетки, выявляя регулярные потенциалы действия. Тепловые карты, показывающие интенсивность кальция над областью высокого увеличения органоида, показывают повышенную интенсивность из-за переходных процессов кальция и отдельных клеток. При попытке этого протокола имейте в виду, что ЭБ и последующие органоиды не прикреплены к нижней части пластины, и мы будем перемещаться с удалением в дополнение к средам, требующим внимательных изменений среды.
Органоиды могут быть культивированы в течение более длительных периодов времени, введенных в методы созревания, или даже подвергаться воздействию внешних стимулов, таких как механическое или электрическое кондиционирование, и даже стрессоров, таких как токсины. Этот метод позволяет получить доступ к стадиям развития сердца плода человека, которые в противном случае недоступны в исследованиях, прокладывая путь для нового понимания развития сердца и этиологии заболеваний.
