Bu protokol, hücre hatlarında tekrarlanabilir, basit bir maliyet etkin şekilde gelişmekte olan insan kalbine yakından benzeyen karmaşık bir 3D yapı oluşturmamızı sağlar. Odalar ve vasküler ağ da dahil olmak üzere kalbin tüm hücre tiplerine yol açan üç farklılaşma adımına sahip tek bir protokolden oluşur. Bu teknik, çok çeşitli insan kardiyovasküler hastalıklarını modellememizi ve etkili farmakolojik tedavileri taramamızı sağlar.
Tasarımının yüksek verimli doğası sayesinde. Bu yöntem, gelişmekte olan insan kalbinin yanı sıra yaygın olarak ilişkili hastalıkları araştırmak için yararlıdır. Bunlardan biri doğuştan kalp rahatsızlığı.
Bu protokol temel hücre kültürü becerileri gerektirir. Dikkatli ve hassas pipetlemenin yanı sıra organoidlerin nazik bir şekilde kullanılmasını öneririz. Farklılaşmadan iki gün önce embriyoid cisimleri veya ÖK'ler oluşturarak başlayın.
Alt bir aradaki HPSC'leri DBPS ile en az 10 saniye yıkayın. O zaman DPBS'ye talip olarak. Bir mililitre oda sıcaklığı ACUTA ekleyin ve mikroskop altında kontrol ederken, ayırmayı teşvik etmek için üç ila beş dakika boyunca her dakika yaklaşık beş kez plakaya hafifçe dokunun.
Ardından reaksiyonun durdurulması için bir mililitre PSC ortamı ve Thias Avin veya Thias ekleyin. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak ve hücreleri toplamak için medyayı kuyuda iki ila üç kez yukarı ve aşağı borulayın. Daha sonra tek hücreli süspansiyonu bir santrifüj tüpüne aktarın ve 300 kez G.Aspirate'de beş dakika döndürün ve hücreleri psc ortamı ve Thias'ın bir mililitresinde yeniden harcayın.
DPBS'deki hücreleri seyreltin. Bir hücre sayacı veya hemo sistometre kullanarak hücreleri sayın ve PSC ortamındaki hücreleri Thias ile mililitre başına 100.000 hücre konsantrasyonuna seyreltin. Yuvarlak bir alt ultra düşük ataşman 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin.
Plakayı üç dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra her kuyudan 50 mikrolitre ortayı dikkatlice çıkarın ve kuyu başına 250 mikrolitre hacim için 37 santigrat dereceye kadar ılık 200 çekirdekli taze PSC ortamı ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatırın.
Her kuyunun bir tarafından 166 mikrolitre veya ortamın üçte ikisini çıkarın, ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca 24 saat boyunca insülinsiz B27 takviyesi, altı mikromolar cheer 990211, 0.875 nanogram kemik morfogenetik protein dört ve mililitre activin A.Incubate mililitre başına 1.5 nanogram içeren RPMI 1640 mikrolitre ekleyin. 24 saat sonra her kuyunun bir tarafından 166 mikrolitre orta çıkarın ve insülinsiz B27 takviyesi ile 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin. 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat kuluçkaya yatır.
İkinci günde kardiyak mezoderm spesifikasyonunu teşvik etmek için, her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve insülinsiz B27 takviyesi ve üç mikromoler Wnt-C59 içeren 166 mikrolitre RPMI 1640 ekleyin ve 48 saat boyunca inkübasyona devam edin. Dördüncü gün, her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve insülinsiz B27 takviyesi ile 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin, ardından 48 saat daha kuluçkaya yatırın. Altıncı günde, her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve B27 takviyesi ile 166 mikrolitre RPMI 1640 ekleyin.
Bu ve sonraki tüm medya değişiklikleri için, insülin ile B27 takviyesi kullanın, 24 saat daha kuluçkaya yatır. Yedinci günde, hücre kültürü pro epikardial farklılaşmaya hazırdır. Her kuyudan 166 mikrolitre orta çıkarın ve B27 takviyesi ve üç mikromolar cheer 99021 içeren 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin.
Daha sonra bir saat kuluçkada, bir saat sonra plakayı inkübatörden çıkarın, her kuyunun bir tarafından 166 mikrolitre orta çıkarın ve B27 takviyesi içeren 166 mikrolitre taze RPMI 1640 ekleyin 48 saat daha inkübasyona devam edin. Toplama işlemine kadar her 48 saatte bir bu işlemi tekrarlayın. Organoidler 15. günde analizlere ve deneylere hazırdır Tüm organoidleri aktarmak için, yaklaşık iki ila üç milimetre çapında bir P200 pipet ucunu, açıklıktan beş ila 10 milimetre kesin.
Pipet pistonuna basın ve ucu organoid ile birlikte yuvarlak tabana dikey olarak yerleştirin. Organoidleri toplayacak ve hedef hedefe aktaracak kadar yaklaşık 100 ila 200 mikrolitre ortam alın. Farklılaşmadan önce EBS siyahlar küresel kütleler olarak görünmeden önce, farklılaşma süreci tam 24 saat boyunca Wnt yolu aktivasyonu ve büyüme faktörü ilavesi ile sıfır gününde başlar.
Wnt C59'un ikinci günde düzenlenmesi, organoidin yaklaşık 200 mikrometreden maksimum bir milimetreye kadar genişlemesine neden olur. İnsan kalbi organoidleri altıncı gün kadar erken atmaya başladı ve organoidlerin% 100'ü 10. Yedinci günün yüksek büyütme görüntüleri organoid, çoğu el ifade hücrelerinin kökeninde kardiyomiyosit olduğunu ve el ikisinin ikinci Heartfield, progenitör hücrelerden miyosit olmayan hücreler olduğunu ortaya koydu.
RNA sıralama verilerinde üçüncü günden itibaren hem birinci hem de ikinci el RNA transkriptleri ifade edilmiştir. FHF işaretleyicileri üçüncü ve 11. İmmünofluoresans lekesi, insan kalbini oluşturan çeşitli insan kalp hücresi tipi soyların varlığını ortaya koydu.
Miyokard ve epikardiyal doku, endokardiyal hücreler, endotel hücreleri ve kardiyak fibroblast gibi. Yukarıdaki hücre soylarını ifade eden belirteçler RNA SAC gen ekspresyon profillerinde de gözlenmiştir. Organoidlerin elektrofizyolojik fonksiyonlarını ölçmek için tüm organoidlerdeki tek tek hücrelerin canlı kalsiyum görüntülemesi kullanılmıştır.
Fluo-4 floresan yoğunluğu, düzenli eylem potansiyellerini ortaya çıkaran hücreden kalsiyum girişi çıkışı nedeniyle zamanla değişti. Organoidin yüksek bir büyütme bölgesi üzerindeki kalsiyum yoğunluklarını gösteren ısı haritaları, kalsiyum geçicileri ve bireysel hücreler nedeniyle yoğunluğun arttığını göstermektedir. Bu protokolü denerken, EBs ve sonraki organoidlerin plakanın altına bağlı olmadığını unutmayın ve özenli medya değişiklikleri gerektiren ortamlara ek olarak kaldırma işlemiyle hareket edeceğiz.
Organoidler, olgunlaşma tekniklerine daha uzun süre kültür olabilir, hatta mekanik veya elektriksel şartlandırma gibi dış uyaranlara ve hatta toksinler gibi stresörlere maruz kalabilir. Bu teknik, insan fetal kalp gelişiminin araştırmalarda erişilemeyen aşamalarına erişim sağlayarak kalp gelişimi ve hastalık etiyolojisi hakkında yeni içgörülerin önünü açmaktadır.
