يسمح لنا هذا البروتوكول بإنشاء بنية ثلاثية الأبعاد معقدة تشبه إلى حد كبير قلب الإنسان النامي بطريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة ، وهي قابلة للاستنساخ عبر خطوط الخلايا. وهو يتألف من بروتوكول واحد مع ثلاث خطوات من التمايز، مما يؤدي إلى جميع أنواع الخلايا من القلب، بما في ذلك الغرف وشبكة الأوعية الدموية. تسمح لنا هذه التقنية بنمذجة مجموعة واسعة من أمراض القلب والأوعية الدموية البشرية وفحص العلاجات الدوائية الفعالة.
بفضل طبيعة الإنتاجية العالية لتصميمها. هذه الطريقة مفيدة في التحقيق في تطور القلب البشري وكذلك الأمراض المرتبطة به عادة. واحد منهم عيوب خلقية في القلب.
يتطلب هذا البروتوكول مهارات أساسية في زراعة الخلايا. نوصي بانتباه وحساسية pipetting فضلا عن التعامل لطيف من organoids. ابدأ بإنشاء أجسام جنينية أو EBs قبل يومين من التمايز.
اغسل مركبات HPSCs المتجانسة الفرعية مع DBPS لمدة 10 ثوان على الأقل. ثم يستنشق DPBS. إضافة ملليلتر واحد من ACUTA درجة حرارة الغرفة والاستفادة بلطف لوحة ما يقرب من خمس مرات كل دقيقة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق للحث على مفرزة، في حين تحقق تحت المجهر.
ثم إضافة ملليلتر واحد من المتوسط PSC وثياس أفين أو ثياس لوقف رد الفعل. ماصة وسائل الإعلام صعودا وهبوطا في البئر، مرتين إلى ثلاث مرات لتوليد تعليق خلية واحدة وجمع الخلايا. ثم نقل تعليق خلية واحدة إلى أنبوب الطرد المركزي وتدور لمدة خمس دقائق في 300 مرة G.Aspirate العملاقة وإعادة قضاء الخلايا في ملليلتر واحد من المتوسط PSC وثياس.
تمييع الخلايا في DPBS. عد الخلايا باستخدام عداد الخلية أو مقياس الكيسات الهيمو وتمييع الخلايا في المتوسط PSC مع ثياس إلى تركيز 100،000 خلية لكل ملليلتر. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا المخففة إلى كل بئر من أسفل مستدير مرفق منخفض جدا 96 لوحة بئر.
طاردة مركزية لوحة في 100 مرة G لمدة ثلاث دقائق واحتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة بعناية إزالة 50 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وإضافة 200 القمامة الأساسية من المتوسط PSC الطازجة، دافئة إلى 37 درجة مئوية لحجم 250 ميكرولتر لكل بئر. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
إزالة 166 ميكرولتر أو ثلثي المتوسطة من جانب واحد من كل بئر، وإضافة 166 ميكرولتر من RPMI 1640 تحتوي على الأنسولين خالية B27 الملحق, ستة ميكرومولار يهتف 990211, 0.875 نانوغرام لكل ملليلتر من البروتين مورفوجينيتي العظام أربعة و 1.5 نانوغرام لكل ملليلتر من أكتيفين A.Incubate لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 24 ساعة إزالة 166 ميكرولتر من المتوسطة من جانب واحد من كل بئر وإضافة 166 ميكرولتر من RPMI الطازجة 1640 مع الأنسولين مجانا B27 الملحق. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
للحث على مواصفات mesoderm القلب في اليوم الثاني، وإزالة 166 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وإضافة 166 ميكرولتر من RPMI 1640، تحتوي على الأنسولين خالية من فيتامين B27 الملحق وثلاثة ميكرومولار Wnt-C59 ومواصلة الحضانة لمدة 48 ساعة. في اليوم الرابع، قم بإزالة 166 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وأضف 166 ميكرولتر من RPMI 1640 الطازج مع ملحق B27 الخالي من الأنسولين، ثم احتضن 48 ساعة أخرى. في اليوم السادس، قم بإزالة 166 ميكرولتر من المتوسط من كل بئر وأضف 166 ميكرولتر من RPMI 1640 مع ملحق B27.
لهذا وجميع التغييرات وسائل الإعلام اللاحقة, استخدام الملحق B27 مع الأنسولين, احتضان لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم السابع، ثقافة الخلية جاهزة للتمايز الملحمي المؤيد. إزالة 166 ميكرولتر من المتوسطة من كل بئر وإضافة 166 ميكرولتر من RPMI الطازجة 1640 التي تحتوي على ملحق B27 وثلاثة يهتف micromolar 99021.
ثم في حضانة لمدة ساعة واحدة، بعد ساعة واحدة إزالة لوحة من الحاضنة، وإزالة 166 ميكرولتر من المتوسطة من جانب واحد من كل بئر وإضافة 166 ميكرولتر من RPMI الطازجة 1640 التي تحتوي على ملحق B27 مواصلة الحضانة لمدة 48 ساعة أخرى. كرر هذه العملية لنا كل 48 ساعة حتى جمع. الأجهزة العضوية جاهزة للتحليلات والتجريب في اليوم 15 لنقل الأعضاء كلها ، وقطع غيض من ماصة P200 ، من خمسة إلى 10 ملليمترات من الفتحة بقطر يتراوح بين 2 و 3 ملليمترات تقريبا.
اضغط على المكبس ماصة وإدراج طرف عموديا في أسفل الجولة جيدا مع organoid. تناول ما يقرب من 100 إلى 200 ميكرولتر من المتوسطة بما يكفي لجمع organoids ونقلها إلى الوجهة المستهدفة. قبل التمايز EBS تظهر كما الجماهير كروية السود عملية التمايز يبدأ في اليوم صفر مع تنشيط مسار WNT وإضافة عامل النمو لمدة 24 ساعة بالضبط.
مزيد من تحرير Wnt C59 في اليوم الثاني النتائج في توسيع organoid من ما يقرب من 200 ميكرومتر إلى حد أقصى من ملليمتر واحد. بدأت الأعضاء القلب البشري ينبض في وقت مبكر من اليوم السادس و 100٪ من organoids أظهرت الضرب مرئية بحلول اليوم 10. كشفت صور التكبير العالية لليوم السابع organoid أن معظم اليد واحدة التعبير عن الخلايا كانت cardiomyocyte في الأصل واليد الثانية كانت الخلايا غير myosite من هارتفيلد الثانية، خلايا السلف.
تم التعبير عن نصوص الحمض النووي الريبي لكل من اليد الأولى واليد الثانية من اليوم الثالث فصاعدا في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. تم التعبير عن علامات FHF بشكل كبير خلال اليومين الثالث وال11 في حين تم التعبير عن علامة SF بشكل أكبر بعد اليوم 13. كشفت بقعة immunofluorescence وجود مختلف الأنساب نوع خلية القلب البشرية التي تشكل قلب الإنسان.
مثل الأنسجة عضلة القلب و epicardial، خلايا الشغاف، الخلايا البطانية، والخلايا الليفية القلبية. كما لوحظت العلامات التي تعبر عن أنساب الخلايا المذكورة أعلاه في ملامح التعبير الجيني RNA SAC. تم استخدام تصوير الكالسيوم الحي للخلايا الفردية في الأعضاء الكاملة لقياس الوظيفة الكهربية للأعضاء.
تباينت كثافة الفلورية فلو-4 مع مرور الوقت بسبب خروج دخول الكالسيوم من الخلية مما يكشف عن إمكانات العمل المنتظمة. تظهر الخرائط الحرارية التي تظهر كثافة الكالسيوم فوق منطقة تكبير عالية من الجهاز ، زيادة الكثافة بسبب عابري الكالسيوم والخلايا الفردية. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن EBs والأعضاء اللاحقة غير متصلة بأسفل اللوحة، وسنتحرك مع الإزالة بالإضافة إلى الوسائط التي تتطلب تغييرات إعلامية منتبهة.
يمكن أن تكون الأجهزة العضوية ثقافة لفترات أطول من الزمن أدخلت على تقنيات النضج، أو حتى تتعرض للمحفزات الخارجية، مثل تكييف الميكانيكية أو الكهربائية، وحتى الضغوطات مثل السموم. تسمح هذه التقنية بالوصول إلى مراحل نمو قلب الجنين البشري التي لا يمكن الوصول إليها في الأبحاث ، مما يمهد الطريق لرؤى جديدة في تطور القلب ومسببات الأمراض.
