Este protocolo nos permite crear una estructura 3D compleja que se asemeja mucho al corazón humano en desarrollo de una manera simple y rentable, que es reproducible a través de líneas celulares. Consiste en un único protocolo con tres pasos de diferenciación, que da lugar a todos los tipos celulares del corazón, incluyendo cámaras y una red vascular. Esta técnica nos permite modelar una amplia gama de enfermedades cardiovasculares humanas y detectar tratamientos farmacológicos efectivos.
Gracias a la naturaleza de alto rendimiento de su diseño. Este método es útil para investigar el corazón humano en desarrollo, así como las enfermedades comúnmente asociadas con él. Uno de ellos son los defectos cardíacos congénitos.
Este protocolo requiere habilidades básicas de cultivo celular. Recomendamos pipeteos atentos y delicados, así como un manejo suave de los organoides. Comience creando cuerpos embrioides o EB dos días antes de la diferenciación.
Lave los HPSC subconfluentes con DBPS durante al menos 10 segundos. A continuación, aspire el DPBS. Agregue un mililitro de ACUTA a temperatura ambiente y golpee suavemente la placa aproximadamente cinco veces cada minuto durante tres a cinco minutos para inducir el desprendimiento, mientras se verifica bajo el microscopio.
Luego agregue un mililitro de medio PSC y Thias Avin o Thias para detener la reacción. Pipetear los medios hacia arriba y hacia abajo en el pozo, dos o tres veces para generar una suspensión de una sola célula y recolectar las células. Luego transfiera la suspensión de una sola célula a un tubo de centrífuga y gire durante cinco minutos a 300 veces G.Aspire el sobrenadante y vuelva a gastar las células en un mililitro de medio PSC y Thias.
Diluir las células en DPBS. Cuente las células usando un contador celular o un hemocisómetro y diluya las células en medio PSC con Thias a una concentración de 100, 000 células por mililitro. Agregue 100 microlitros de suspensión de células diluidas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja de fondo redondo.
Centrifugar la placa a 100 veces G durante tres minutos e incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas, retire cuidadosamente 50 microlitros de medio de cada pozo y agregue 200 camadas de núcleo de medio PSC fresco, caliente a 37 grados Celsius para un volumen de 250 microlitros por pozo. Incubar las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Retire 166 microlitros o dos tercios de medio de un lado de cada pozo, y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 que contengan suplemento de B27 sin insulina, seis 990211 de alegría micromolar, 0.875 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea cuatro y 1.5 nanogramos por mililitro de Activina A.Incube durante 24 horas a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas retire 166 microlitros de medio de un lado de cada pocillo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco con suplemento de B27 sin insulina. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Para inducir la especificación del mesodermo cardíaco en el segundo día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640, que contengan suplemento de B27 sin insulina y tres micromolares Wnt-C59 y continúe la incubación durante 48 horas. En el cuarto día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco con suplemento de B27 sin insulina, luego incube otras 48 horas. En el sexto día, retire 166 microlitros de medio de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 con suplemento de B27.
Para este y todos los cambios de medios posteriores, use suplemento de B27 con insulina, incube durante otras 24 horas. En el séptimo día, el cultivo celular está listo para la diferenciación pro epicárdica. Retire 166 microlitros de medio de cada pocillo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B27 y tres micromolares cheer 99021.
Luego, en incubar durante una hora, después de una hora retire la placa de la incubadora, retire 166 microlitros de medio de un lado de cada pozo y agregue 166 microlitros de RPMI 1640 fresco que contenga suplemento de B27 continúe la incubación durante otras 48 horas. Repite este proceso cada 48 horas hasta la recogida. Los organoides están listos para análisis y experimentación el día 15 Para transferir los organoides completos, corte la punta de una pipeta P200, de cinco a 10 milímetros de la abertura con un diámetro de aproximadamente dos a tres milímetros.
Presione el émbolo de pipeta e inserte la punta verticalmente en el pozo inferior redondo con el organoide. Tome aproximadamente de 100 a 200 microlitros de medio suficiente para recolectar los organoides y transferirlos al destino objetivo. Antes de que la EBS de diferenciación aparezca como masas esféricas negras, el proceso de diferenciación comienza en el día cero con una activación de la vía Wnt y la adición del factor de crecimiento durante exactamente 24 horas.
Además, la edición de Wnt C59 en el segundo día da como resultado un agrandamiento del organoide de aproximadamente 200 micrómetros a un máximo de un milímetro. Los organoides del corazón humano comenzaron a latir tan pronto como el día seis y el 100% de los organoides mostraron latidos visibles en el día 10. Las imágenes de alto aumento del organoide del día siete revelaron que la mayoría de las células que expresaban la mano uno eran de origen cardiomiótico y la mano dos eran células no miositas de segunda células progenitoras del campo cardíaco.
Las transcripciones de ARN tanto para la mano uno como para la mano dos se expresaron a partir del tercer día en los datos de secuenciación de ARN. Los marcadores FHF se expresaron altamente durante los días tres y 11, mientras que el marcador SF se expresó más altamente después del día 13. La tinción de inmunofluorescencia reveló la presencia de varios linajes de tipo de células cardíacas humanas que componen el corazón humano.
Como el tejido miocárdico y epicárdico, las células endocárdicas, las células endoteliales y los fibroblastos cardíacos. Los marcadores que expresan los linajes celulares anteriores también se observaron en los perfiles de expresión del gen RNA SAC. Se utilizaron imágenes de calcio vivo de células individuales en organoides enteros para medir la función electrofisiológica de los organoides.
La intensidad de la fluorescencia fluo-4 varió con el tiempo debido a la salida de entrada de calcio de la célula que revela potenciales de acción regulares. Los mapas de calor que muestran las intensidades de calcio sobre una región de alto aumento del organoide, muestran una mayor intensidad debido a los transitorios de calcio y las células individuales. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que los EB y los organoides posteriores no están unidos a la parte inferior de la placa, y nos moveremos con la eliminación además de los medios que requieren cambios de medios atentos.
Los organoides pueden ser cultivados durante períodos de tiempo más largos introducidos en las técnicas de maduración, o incluso expuestos a estímulos externos, como el acondicionamiento mecánico o eléctrico, e incluso a factores estresantes como las toxinas. Esta técnica permite el acceso a etapas del desarrollo del corazón fetal humano que de otro modo serían inaccesibles en la investigación, allanando el camino para nuevos conocimientos sobre el desarrollo del corazón y la etiología de la enfermedad.
