Los experimentos FRET de una sola molécula utilizando sondas unidas a la superficie se han realizado casi exclusivamente en moléculas inmovilizadas en el pasado. Sin embargo, muchas biomoléculas se difunden y se pueden analizar con nuestro método. La combinación de FRET de una sola molécula con el seguimiento permite analizar no solo los rastros de tiempo de deficiencia de FRET de las sondas en movimiento, sino también investigar aspectos espaciotemporales como el comportamiento de difusión.
Nuestro método es compatible con una variedad de diferentes sondas basadas en FRET. Por ejemplo, podría proporcionar información sobre las fuerzas moleculares, la dinámica conformacional y la cinética de unión en experimentos con células vivas. Los experimentos FRET de una sola molécula de alta calidad son notoriamente difíciles de realizar.
Para una cuantificación confiable, es importante registrar datos con una buena relación señal-ruido y pistas de una sola molécula de longitud suficiente. Para comenzar la medición de la muestra, excite los fluoróforos del donante y del aceptor durante un tiempo de iluminación adecuado mientras activa la cámara y espere hasta que se habilite la lectura de la cámara. Repita la excitación de los fluoróforos donante y aceptor alternativamente.
Elija que el número de repeticiones sea lo suficientemente grande como para garantizar el fotoblanqueo de al menos un fluoróforo por sonda dentro del campo de visión, lo que permite el análisis de fotoblanqueo paso a paso para discriminar las señales de una sola molécula de los agregados. Especifique la secuencia de iluminación para permitir la selección de fotogramas de excitación donantes y aceptores, así como fotogramas para la segmentación de imágenes a partir de secuencias de imágenes grabadas. Simultáneamente, analice los conjuntos de datos registrados utilizando la misma configuración de iluminación.
Con este fin, asigne un identificador y un patrón que coincida con los nombres de archivo de secuencia de imágenes respectivos a cada conjunto de datos. Además, defina conjuntos de datos específicos para fines especiales, como registros de marcadores fiduciarios para el registro de imágenes, perfiles de luz de excitación para la corrección de campo plano y, opcionalmente, muestras solo para donantes y solo para aceptadores para determinar los factores de corrección. A continuación, seleccione los canales de emisión y las imágenes en bruto si ambos canales se graban con una sola cámara.
Para ello, utilice el widget gráfico adecuado para seleccionar las regiones adecuadas para la emisión de donantes y aceptadores, luego localice los marcadores fiduciarios en ambos canales de emisión y realice el registro de imágenes. Utilice la interfaz de usuario proporcionada para encontrar los parámetros adecuados para el algoritmo de localización para los canales de emisión de donantes y aceptadores. A continuación, establezca parámetros de localización de una sola molécula para sondas FRET sobre la excitación del donante en la suma de las imágenes obtenidas de las emisiones del donante y del aceptor, luego establezca parámetros de localización para las sondas sobre la excitación del aceptor en el canal de emisión del aceptor.
Localice las sondas FRET en la excitación del donante y del aceptor de forma independiente en todos los fotogramas. Los resultados se combinan en una tabla que contiene el número de fotograma original, las coordenadas bidimensionales y un identificador que hace referencia al archivo de imagen de origen. Para rastrear y medir la intensidad de la fluorescencia, elija las opciones apropiadas para que el algoritmo Trackpy vincule las localizaciones de la sonda FRET en trayectorias.
A continuación, utilizando la funcionalidad del software de análisis, procese datos de imágenes auxiliares de secuencias de imágenes. Extraiga imágenes adicionales grabadas para facilitar la segmentación marcada por S en la secuencia de excitación. Finalmente, determine los perfiles de luz de excitación del donante y aceptor en todo el campo de visión a partir de imágenes grabadas en una muestra densamente etiquetada.
Para los pasos iniciales de filtrado, descarte las señales con funciones de propagación de puntos superpuestas, ya que es difícil determinar sus intensidades de fluorescencia de manera confiable. En el caso de iluminación no homogénea, acepte solo señales ubicadas en regiones bien iluminadas dentro del campo de visión para garantizar una buena relación señal-ruido. Si se estudia el FRET intramolecular, restringir el análisis a aquellas trayectorias presentes desde el inicio de la secuencia de imágenes.
A continuación, ejecute la corrección de campo plano, que utiliza los perfiles de fuente de luz de excitación obtenidos anteriormente para invertir las variaciones de intensidad de fluorescencia dependientes de la posición causadas por la iluminación no homogénea, luego calcule la eficiencia FRET aparente y la estequiometría aparente. Para realizar un análisis gradual del fotoblanqueo para discriminar entre sondas moleculares individuales y agregados, encuentre parámetros apropiados para el algoritmo de detección de punto de cambio en la excitación del donante y el aceptor de forma independiente. A continuación, ejecute el algoritmo de detección de punto de cambio.
Para eliminar la pista que muestra un comportamiento ambiguo de fotoblanqueo, defina los umbrales de intensidad por debajo de los cuales un fluoróforo se considera blanqueado y, a continuación, seleccione una de las siguientes opciones. Opción uno en la que el fluoróforo aceptor blanquea en un solo paso mientras que el donante no muestra blanqueamiento parcial. Opción dos en la que el donante blanquea en un solo paso mientras no hay blanqueamiento parcial del aceptor.
Opción tres en la que cualquiera de los blanqueadores fluoróforos en un solo paso mientras que el otro no blanquea parcialmente. Y la opción cuatro en la que los fluoróforos donantes y aceptores muestran fotoblanqueo de un solo paso o ningún fotoblanqueo en absoluto. A continuación, calcule los factores de corrección para la fuga de emisión del donante en el canal aceptor, la excitación del aceptor directo, las eficiencias de detección y las eficiencias de excitación.
A continuación, utilice los factores de corrección para calcular la eficiencia FRET a partir de la eficiencia aparente y la estequiometría a partir de la estequiometría aparente. Para un filtrado adicional, seleccione solo los puntos de datos anteriores al primer evento de blanqueo en cada trayectoria. Además, para restringir el análisis a sondas de una sola molécula, acepte solo trayectorias con al menos el 75% de los puntos de datos dentro de los límites de estequiometría apropiados.
A continuación, realice la segmentación de imágenes a través de métodos de umbral global o adaptativo en las imágenes auxiliares apropiadas para restringir el análisis a distintas regiones dentro del campo de visión. Cree gráficos de eficiencia versus estequiometría para verificar que las señales de estequiometría incorrecta se hayan identificado y eliminado correctamente. A continuación, trace los histogramas de las eficiencias de FRET para proporcionar una visión general bien establecida de las distribuciones de eficiencia de FRET y agrupe los histogramas para una comparación conveniente de los resultados de diferentes experimentos.
Aprovechando las bibliotecas científicas de Python, es posible evaluar más a fondo los datos dentro del cuaderno, realizando, por ejemplo, análisis de difusión. La visualización y el seguimiento del evento FRET de una sola molécula se muestran aquí. Los eventos FRET filtrados se representan mediante gráficas de eficiencia versus estequiometría en un histograma de eficiencia FRET.
Además, los parámetros de movilidad se pueden investigar trazando una trayectoria individual en una gráfica XY o una gráfica de desplazamiento cuadrado medio. La salida de nuestra plataforma nos permite identificar aún más las transiciones en los rastros de tiempo de eficiencia FRET de las sondas móviles. Por ejemplo, para evaluar los cambios conformacionales de las biomoléculas.
Utilizando un sensor de fuerza basado en FRET, la plataforma de análisis nos permitió cuantificar los eventos de fuerza de una sola molécula dentro de la sinapsis inmunológica durante la señalización temprana de las células T.
