Experimentos fret de molécula única usando sondas ligadas à superfície foram realizados quase exclusivamente em moléculas imobilizadas no passado. No entanto, muitas biomoléculas difusas e podem ser analisadas com nosso método. A combinação de FRET de molécula única com o rastreamento torna possível analisar não apenas traços de tempo de deficiência de FRET de sondas móveis, mas também investigar aspectos espessotemporais, como o comportamento difuso.
Nosso método é compatível com uma variedade de diferentes sondas baseadas em FRET. Por exemplo, poderia fornecer insights sobre forças moleculares, dinâmica conformacional e cinética de ligação em experimentos de células vivas. Experimentos fret de molécula única de alta qualidade são notoriamente difíceis de executar.
Para quantificação confiável, é importante registrar dados em uma boa relação sinal-ruído e faixas de uma molécula de comprimento suficiente. Para iniciar a medição da amostra, excite o doador e os fluoroforos aceitádores para um tempo de iluminação apropriado enquanto aciona a câmera e espere até que a leitura da câmera seja ativada. Repita a excitação do doador e dos fluoroforos aceitador alternativamente.
Escolha o número de repetições para ser grande o suficiente para garantir o fotobleaching de pelo menos um fluoróforo por sonda dentro do campo de visão permitindo que a análise de fotobleaching stepwise discriminar sinais de molécula única a partir de agregados. Especifique a sequência de iluminação para permitir a seleção de quadros de excitação doador e aceitador, bem como quadros para segmentação de imagens a partir de sequências de imagem gravadas. Simultaneamente, analise os conjuntos de dados registrados usando as mesmas configurações de iluminação.
Para isso, atribua um identificador e um padrão que corresponda aos respectivos nomes de arquivos de sequência de imagem a cada conjunto de dados. Além disso, defina conjuntos de dados específicos para fins especiais, como registros de marcadores fiduciários para registro de imagem, perfis de luz de excitação para correção de campo plano e, opcionalmente, amostras somente para doadores e aceitadores para determinar fatores de correção. Em seguida, selecione canais de emissão e imagens brutas se ambos os canais forem gravados usando uma única câmera.
Para isso, use o widget gráfico apropriado para selecionar regiões apropriadas para emissão de doadores e aceitadores e, em seguida, localize marcadores fiduciais em ambos os canais de emissão e realize o registro de imagens. Use a interface de usuário fornecida para encontrar os parâmetros apropriados para o algoritmo de localização para canais de emissão de doadores e aceitadoras. Em seguida, defina parâmetros de localização de molécula única para sondas FRET após a excitação do doador na soma das imagens obtidas das emissões de doadores e aceitadores, em seguida, defina parâmetros de localização para sondas após a excitação aceitadora no canal de emissão de aceitadores.
Localize as sondas FRET sobre a excitação de doadores e aceitadores independentemente em todos os quadros. Os resultados são mesclados em uma tabela que contém o número do quadro original, coordenadas bidimensionais e um identificador referente ao arquivo de imagem de origem. Para rastrear e medir a intensidade da fluorescência, escolha opções apropriadas para o algoritmo Trackpy para vincular localizações de sonda FRET em trajetórias.
Em seguida, usando a funcionalidade do software de análise, processe dados de imagem auxiliares de sequências de imagens. Extrair imagens adicionais gravadas para facilitar a segmentação marcada por S na sequência de excitação. Por fim, determine os perfis de luz de excitação do doador e do usuário em todo o campo de visão a partir de imagens gravadas em uma amostra densamente rotulada.
Para as etapas iniciais de filtragem, descarte sinais com funções de propagação de ponto sobrepostas, pois é difícil determinar suas intensidades de fluorescência de forma confiável. No caso da iluminação inhomogenous, aceite apenas sinais localizados em regiões bem iluminadas dentro do campo de visão para garantir uma boa relação sinal-ruído. Se estudar o FRET intramolecular, restrinja a análise às trajetórias presentes desde o início da sequência da imagem.
Em seguida, execute a correção de campo plano, que utiliza os perfis de fonte de luz de excitação obtidos anteriormente para reverter as variações de intensidade de fluorescência dependentes da posição causadas pela iluminação inhomogenous, em seguida, calcular a aparente eficiência de FRET e a aparente estequiometria. Para realizar a análise passo a passo do fotobleaching para discriminar entre sondas moleculares únicas e agregados, encontre parâmetros apropriados para o algoritmo de detecção de ponto de mudança sobre a excitação de doadores e aceitadores independentemente. Em seguida, execute o algoritmo de detecção de ponto de mudança.
Para remover a faixa mostrando comportamento fotobleaching ambíguo, defina limiares de intensidade abaixo dos quais um fluoróforo é considerado branqueado e selecione uma das seguintes opções. Opção um em que o fluoróforo aceitante branqueia em um único passo enquanto o doador não mostra branqueamento parcial. Opção dois em que o doador branqueia em um único passo enquanto não há um branqueamento parcial.
Opção três em que ou fluorfora em um único passo, enquanto o outro não alveja parcialmente. E opção quatro em que doador e fluoroforos aceitantes mostram fotobleaching de passo único ou nenhuma fotobleaching em tudo. Em seguida, calcule os fatores de correção para o vazamento de emissões de doadores no canal de aceitação, excitação aceitadora direta, eficiência de detecção e eficiência de excitação.
Em seguida, use os fatores de correção para calcular a eficiência do FRET a partir da eficiência aparente e da estequiometria a partir de estequiometria aparente. Para posterior filtragem, selecione apenas pontos de dados de antes do primeiro evento de branqueamento em cada trajetória. Além disso, para restringir a análise a sondas de molécula única, aceite apenas trajetórias com pelo menos 75% dos pontos de dados dentro dos limites apropriados de estequiometria.
Em seguida, realize a segmentação de imagens através de métodos de limiar global ou adaptável nas imagens auxiliares apropriadas para restringir a análise a regiões distintas no campo de visão. Crie eficiência versus parcelas de estequiometria para verificar se sinais de estequiometria incorreta foram corretamente identificados e removidos. Em seguida, plote histogramas de eficiências fret para fornecer uma visão geral bem estabelecida das distribuições de eficiência da FRET e agrupar os histogramas para comparação conveniente de resultados de diferentes experimentos.
Aproveitando as bibliotecas científicas python, é possível avaliar ainda mais os dados dentro do notebook, realizando, por exemplo, análise de difusão. Visualização e rastreamento de evento FRET de molécula única são mostrados aqui. Os eventos FRET filtrados são representados por gráficos de eficiência versus estequiometria em um histograma de eficiência FRET.
Além disso, os parâmetros de mobilidade podem ser investigados plotando um caminho de trajetória individual em um enredo XY ou um gráfico de deslocamento quadrado médio. A saída de nossa plataforma nos permite identificar ainda mais transições em traços de tempo de eficiência do FRET de sondas móveis. Por exemplo, avaliar mudanças conformais das biomoléculas.
Usando um sensor de força baseado em FRET, a plataforma de análise nos permitiu quantificar eventos de força de molécula única dentro da sinapse imunológica durante a sinalização precoce de células T.
