Des expériences FRET à molécule unique utilisant des sondes liées à la surface ont été réalisées presque exclusivement sur des molécules immobilisées dans le passé. Cependant, de nombreuses biomolécules diffusent et peuvent être analysées avec notre méthode. La combinaison de FRET à molécule unique avec le suivi permet d’analyser non seulement les traces temporelles de déficit FRET des sondes en mouvement, mais également d’étudier les aspects spatio-temporels tels que le comportement de diffusion.
Notre méthode est compatible avec une variété de sondes à base de FRET. Par exemple, il pourrait fournir des informations sur les forces moléculaires, la dynamique conformationnelle et la cinétique de liaison dans les expériences sur des cellules vivantes. Les expériences FRET monomoléculaires de haute qualité sont notoirement difficiles à réaliser.
Pour une quantification fiable, il est important d’enregistrer les données à un bon rapport signal/bruit et des pistes à molécule unique d’une longueur suffisante. Pour commencer la mesure de l’échantillon, excitez le donneur et acceptez les fluorophores pendant un temps d’éclairage approprié tout en déclenchant la caméra et attendez que la lecture de la caméra soit activée. Répétez l’excitation du donneur et acceptez les fluorophores alternativement.
Choisissez le nombre de répétitions suffisamment important pour assurer le photoblanchiment d’au moins un fluorophore par sonde dans le champ de vision, ce qui permet une analyse de photoblanchiment par étapes pour distinguer les signaux d’une seule molécule des agrégats. Spécifiez la séquence d’éclairage pour permettre la sélection des images d’excitation du donneur et de l’accepteur ainsi que des images pour la segmentation d’image à partir de séquences d’images enregistrées. Simultanément, analysez les jeux de données enregistrés en utilisant les mêmes paramètres d’éclairage.
À cette fin, attribuez un identificateur et un modèle qui correspondent aux noms de fichiers de séquence d’images respectifs à chaque jeu de données. En outre, définissez des ensembles de données spécifiques à des fins spéciales, telles que des enregistrements de marqueurs fiducaux pour l’enregistrement d’images, des profils lumineux d’excitation pour la correction de champ plat et, éventuellement, des échantillons de donneur uniquement et d’acceptation uniquement pour déterminer les facteurs de correction. Ensuite, sélectionnez les canaux d’émission et les images brutes si les deux canaux sont enregistrés à l’aide d’une seule caméra.
Pour cela, utilisez le widget graphique approprié pour sélectionner les régions appropriées pour l’émission du donneur et de l’accepteur, puis localisez les marqueurs fiduciaires dans les deux canaux d’émission et effectuez l’enregistrement de l’image. Utilisez l’interface utilisateur fournie pour trouver les paramètres appropriés pour l’algorithme de localisation des canaux d’émission donneur et accepteur. Ensuite, définissez les paramètres de localisation d’une seule molécule pour les sondes FRET lors de l’excitation du donneur dans la somme des images obtenues à partir des émissions du donneur et de l’accepteur, puis définissez les paramètres de localisation des sondes lors de l’excitation de l’accepteur dans le canal d’émission de l’accepteur.
Localisez les sondes FRET sur l’excitation du donneur et de l’accepteur indépendamment dans toutes les trames. Les résultats sont fusionnés en un seul tableau qui contient le numéro d’image d’origine, les coordonnées bidimensionnelles et un identificateur faisant référence au fichier image source. Pour suivre et mesurer l’intensité de fluorescence, choisissez les options appropriées pour l’algorithme Trackpy afin de lier les localisations de sonde FRET aux trajectoires.
Ensuite, à l’aide de la fonctionnalité du logiciel d’analyse, traitez les données d’image auxiliaires à partir de séquences d’images. Extrayez des images supplémentaires enregistrées pour faciliter la segmentation marquée par S dans la séquence d’excitation. Enfin, déterminez les profils lumineux d’excitation du donneur et de l’accepteur dans le champ de vision à partir d’images enregistrées sur un échantillon densément étiqueté.
Pour les étapes initiales de filtrage, éliminez les signaux dont les fonctions d’étalement ponctuel se chevauchent, car il est difficile de déterminer de manière fiable leurs intensités de fluorescence. Dans le cas d’un éclairage inhomogène, n’acceptez que les signaux situés dans des régions bien éclairées du champ de vision afin d’assurer un bon rapport signal/bruit. Si vous étudiez le FRET intramoléculaire, limitez l’analyse aux trajectoires présentes dès le début de la séquence d’images.
Ensuite, exécutez la correction de champ plat, qui utilise les profils de source lumineuse d’excitation obtenus précédemment pour inverser les variations d’intensité de fluorescence dépendantes de la position causées par un éclairage inhomogène, puis calculez l’efficacité FRET apparente et la stœchiométrie apparente. Pour effectuer une analyse par étapes du photoblanchiment pour discriminer entre les sondes moléculaires uniques et les agrégats, trouver des paramètres appropriés pour l’algorithme de détection du point de changement sur l’excitation du donneur et de l’accepteur indépendamment. Exécutez ensuite l’algorithme de détection des points de changement.
Pour supprimer la trace montrant un comportement ambigu de photoblanchiment, définissez des seuils d’intensité en dessous desquels un fluorophore est considéré comme blanchi, puis sélectionnez l’une des options suivantes. Première option dans laquelle l’accepteur fluorophore blanchit en une seule étape tandis que le donneur ne montre aucun blanchiment partiel. Deuxième option dans laquelle le donneur blanchit en une seule étape alors qu’il n’y a pas de blanchiment partiel de l’accepteur.
Troisième option dans laquelle l’un ou l’autre fluorophore blanchit en une seule étape tandis que l’autre ne blanchit pas partiellement. Et la quatrième option dans laquelle les fluorophores donneurs et accepteurs montrent un photoblanchiment en une seule étape ou pas de photoblanchiment du tout. Calculez ensuite les facteurs de correction pour la fuite d’émission du donneur dans le canal accepteur, l’excitation directe de l’accepteur, les efficacités de détection et les efficacités d’excitation.
Ensuite, utilisez les facteurs de correction pour calculer l’efficacité FRET à partir de l’efficacité apparente et la stœchiométrie à partir de la stœchiométrie apparente. Pour un filtrage plus poussé, sélectionnez uniquement les points de données avant le premier événement de blanchiment dans chaque trajectoire. De plus, pour limiter l’analyse aux sondes à molécule unique, n’acceptez que les trajectoires avec au moins 75% des points de données dans les limites de stœchiométrie appropriées.
Effectuez ensuite une segmentation d’image via des méthodes de seuilage globales ou adaptatives sur les images auxiliaires appropriées pour limiter l’analyse à des régions distinctes dans le champ de vision. Créez des diagrammes d’efficacité par rapport à la stœchiométrie pour vérifier que les signaux de stœchiométrie incorrecte ont été correctement identifiés et supprimés. Ensuite, tracez les histogrammes des efficacités FRET pour fournir une vue d’ensemble bien établie des distributions d’efficacité FRET et regroupez les histogrammes pour une comparaison pratique des résultats de différentes expériences.
En tirant parti des bibliothèques python scientifiques, il est possible d’évaluer davantage les données dans le bloc-notes, en effectuant, par exemple, une analyse de diffusion. La visualisation et le suivi de l’événement FRET à molécule unique sont présentés ici. Les événements FRET filtrés sont représentés par des diagrammes d’efficacité par rapport aux stœchiométries dans un histogramme d’efficacité FRET.
En outre, les paramètres de mobilité peuvent être étudiés en traçant un chemin de trajectoire individuel dans un diagramme XY ou un diagramme de déplacement carré moyen. La sortie de notre plate-forme nous permet d’identifier davantage les transitions dans les traces temporelles d’efficacité FRET des sondes mobiles. Par exemple, pour évaluer les changements conformationnels des biomolécules.
À l’aide d’un capteur de force basé sur FRET, la plate-forme d’analyse nous a permis de quantifier les événements de force d’une seule molécule dans la synapse immunologique au cours de la signalisation précoce des lymphocytes T.
