ניסויי FRET בעלי מולקולה אחת באמצעות גשושיות הקשורות לפני השטח בוצעו כמעט אך ורק על מולקולות משותקות בעבר. עם זאת, ביומולקולות רבות מפוזרות וניתן לנתח אותן בשיטה שלנו. שילוב של FRET מולקולה אחת עם מעקב מאפשר לנתח לא רק עקבות זמן חוסר FRET של בדיקות נעות, אלא גם לחקור היבטים מרחביים כגון התנהגות מפוזרת.
השיטה שלנו תואמת למגוון בדיקות שונות המבוססות על FRET. לדוגמה, הוא יכול לספק תובנות לגבי כוחות מולקולריים, דינמיקה קונפורמציה וקינטיקה מחייבת בניסויים בתאים חיים. ניסויי FRET באיכות גבוהה של מולקולה אחת ידועים לשמצה כקשים לביצוע.
לכימות אמין, חשוב להקליט נתונים ביחס אות לרעש טוב ומסלולי מולקולה אחת באורך מספיק. כדי להתחיל במדידה מדגמית, רגש את פלואורופורים התורם והמקבל לזמן תאורה מתאים תוך הפעלת המצלמה והמתן עד לקריאת המצלמה. חזור על עירור של התורם ומקבל פלואורופורים לחילופין.
בחר את מספר החזרות להיות גדול מספיק כדי להבטיח צילום של לפחות פלואורופור אחד לכל בדיקה בתוך שדה הראייה המאפשר ניתוח צילום צעדים כדי להפלות אותות מולקולה אחת מצרגטים. ציין את רצף התאורה כדי לאפשר את בחירת מסגרות עירור התורם והמקבל וכן מסגרות לפילוח תמונות מתוך רצפי תמונות מוקלטים. בו-זמנית, נתח את ערכות הנתונים שנרשמו באמצעות אותן הגדרות תאורה.
לשם כך, הקצה מזהה ותבנית התואמים לשמות הקבצים המתאימים של רצף התמונות לכל ערכת נתונים. בנוסף, הגדר ערכות נתונים ספציפיות למטרות מיוחדות כגון הקלטות של סמנים fiducial לרישום תמונה, פרופילי תאורת עירור לתיקון שדה שטוח, ודוגמאות אופציונליות לתורם בלבד ומקבל בלבד כדי לקבוע גורמי תיקון. לאחר מכן, בחר ערוצי פליטה ותמונות גולמיות אם שני הערוצים מוקלטים באמצעות מצלמה אחת.
לשם כך, השתמש בווידג'ט הגרפי המתאים כדי לבחור אזורים מתאימים לפליטת תורמים ומקבלים, ולאחר מכן הפוך סמנים פימודיים לשפות אחרות בשני ערוצי הפליטה ולבצע רישום תמונה. השתמש בממשק המשתמש שסופק כדי למצוא את הפרמטרים המתאימים עבור אלגוריתם הלוקליזציה עבור ערוצי פליטת התורם והמקבל. לאחר מכן, הגדר פרמטרים של לוקליזציה של מולקולה אחת עבור בדיקות FRET בעת עירור התורם בסכום התמונות המתקבלות מפליטות תורמים ומקבלים, ולאחר מכן הגדר פרמטרים של לוקליזציה לבדיקות בעת עירור מקבל בערוץ פליטת המקבלים.
לוקליזציה של בדיקות ה- FRET על עירור תורמים ומקבלים באופן עצמאי בכל המסגרות. התוצאות ממוזגות לטבלה אחת המכילה את מספר המסגרת המקורי, קואורדינטות דו-ממדיות ומזהה המפנה לקובץ תמונת המקור. כדי לעקוב ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות, בחר באפשרויות המתאימות עבור אלגוריתם Trackpy כדי לקשר לוקליזציה של בדיקות FRET למסלולים.
לאחר מכן, באמצעות הפונקציונליות של תוכנת הניתוח, עבד נתוני תמונה עזר מרצף תמונות. חלץ תמונות נוספות שנרשמו כדי להקל על פילוח המסומן על-ידי S ברצף העירור. לבסוף, קבעו את פרופילי אורות עירור התורם והמקבלים ברחבי שדה הראייה מתמונות שנרשמו במדגם בעל תווית צפופה.
עבור שלבי הסינון הראשוניים, מחק אותות עם פונקציות של התפשטות נקודות חופפות מכיוון שקשה לקבוע את עוצמות הפלואורסצנטיות שלהם באופן אמין. במקרה של תאורה לאהומוגנית, קבל רק אותות הממוקמים באזורים מוארים היטב בתוך שדה הראייה כדי להבטיח יחס אות לרעש טוב. אם אתה לומד FRET תוך גולגולתי, הגבל את הניתוח למסלולים הקיימים מתחילת רצף התמונות.
לאחר מכן, בצע את תיקון השדה השטוח, המשתמש בפרופילי מקור אור עירור שהושגו קודם לכן כדי להפוך את וריאציות עוצמת הפלואורסצנטיות התלויות במיקום הנגרמות על ידי תאורה לא הומוגנית, ולאחר מכן לחשב את יעילות FRET לכאורה ואת stoichiometry לכאורה. כדי לבצע ניתוח צעדי של הלבנת פוטוקלור להפלות בין בדיקות מולקולריות בודדות לבין אגרגטים, מצא פרמטרים מתאימים לאלגוריתם זיהוי נקודת השינוי על עירור התורם והמקבל באופן עצמאי. לאחר מכן בצע את אלגוריתם זיהוי נקודת השינוי.
כדי להסיר רצועה המציגה אופן פעולה רב-משמעי של הלבנת פוטו,הגדר סף עוצמה שמתחתיו פלואורופור נחשב מולבן, ולאחר מכן בחר אחת מהאפשרויות הבאות. אפשרות ראשונה שבה הפלואורופור מקבל מלבין בצעד אחד בעוד התורם אינו מראה הלבנה חלקית. אפשרות שנייה שבה התורם מלבין בצעד אחד בזמן שאין הלבנת קבלה חלקית.
אפשרות שלישית שבה כל הפלואורופור מלבין בצעד אחד בעוד השני אינו אקונומיקה חלקית. ואפשרות 4 שבה פלואורופורים של תורמים ומקבלים מראים צילום חד-שלבי או בלי הלבנת תמונות כלל. לאחר מכן חשב את גורמי התיקון עבור דליפת פליטת תורמים לערוץ המקובל, עירור קבל ישיר, יעילות זיהוי ויעילות עירור.
לאחר מכן, השתמש בגורמי התיקון כדי לחשב את יעילות FRET מיעילות לכאורה וסטואיכיומטריה מסטויצ'ומטריה לכאורה. לסינון נוסף, בחר רק נקודות נתונים מלפני אירוע ההלבנה הראשון בכל מסלול. בנוסף, כדי להגביל את הניתוח לבדיקות מולקולה אחת, לקבל רק מסלולים עם לפחות 75% של נקודות נתונים בתוך גבולות stoichiometry המתאימים.
לאחר מכן בצעו פילוח תמונות באמצעות שיטות סף כלליות או אדפטיביות בתמונות העזר המתאימות כדי להגביל את הניתוח לאזורים נפרדים בתוך שדה הראייה. צור יעילות לעומת התוויות סטויצ'ומטריה כדי לוודא שאותות של סטויצ'ומטריה שגויה זוהו והוסרו כראוי. לאחר מכן התווה היסטוגרמה של יעילות FRET כדי לספק סקירה מבוססת היטב של הפצות יעילות FRET ולקבץ את ההיסטוגרמות להשוואה נוחה של תוצאות מניסויים שונים.
תוך ניצול ספריות פייתון מדעיות, ניתן להעריך עוד יותר את הנתונים בתוך המחברת, ולבצע, למשל, ניתוח דיפוזיה. הדמיה ומעקב אחר אירוע FRET של מולקולה אחת מוצגים כאן. אירועי FRET מסוננים מיוצגים על-ידי יעילות לעומת התוויות סטויצ'ומטריה בהיסטוגרמת יעילות FRET.
יתר על כן, ניתן לחקור פרמטרי ניידות על-ידי התוויית נתיב מסלול בודד בעלילת XY או עלילת תזוזה מרובעת ממוצעת. הפלט של הפלטפורמה שלנו מאפשר לנו לזהות עוד יותר מעברים בעקבות זמן היעילות של FRET של בדיקות ניידות. לדוגמה, כדי להעריך שינויים קונפורמציה של ביומולקולות.
באמצעות חיישן כוח מבוסס FRET, פלטפורמת הניתוח אפשרה לנו לכמת אירועי כוח של מולקולה אחת בתוך הסינפסה החיסונית במהלך איתות תאי T מוקדם.
