Одномолекулярные эксперименты FRET с использованием поверхностных зондов в прошлом проводились почти исключительно на обездвиженных молекулах. Тем не менее, многие биомолекулы диффундируют и могут быть проанализированы с помощью нашего метода. Сочетание одномолекулярного FRET с отслеживанием позволяет анализировать не только следы времени дефицита FRET движущихся зондов, но и исследовать пространственно-временные аспекты, такие как диффузионное поведение.
Наш метод совместим с различными зондами на основе FRET. Например, он может дать представление о молекулярных силах, конформационной динамике и кинетике связывания в экспериментах с живыми клетками. Высококачественные одномолекулярные эксперименты с FRET, как известно, трудно выполнить.
Для надежной количественной оценки важно записывать данные с хорошим соотношением сигнал/шум и одномолекулярными треками достаточной длины. Чтобы начать измерение образца, возбуждайте фторофоры донора и акцептора в течение соответствующего времени освещения при срабатывании камеры и дождитесь включения считывания показаний камеры. Повторите возбуждение донорских и акцепторных флуорофоров альтернативно.
Выберите количество повторов, которое должно быть достаточно большим, чтобы обеспечить фотоотбеливание по крайней мере одного флуорофора на зонд в поле зрения, позволяя проводить ступенчатый анализ фотоотбеливания для различения одномолекулярных сигналов от агрегатов. Укажите последовательность освещения, чтобы разрешить выбор кадров возбуждения донора и акцептора, а также кадров для сегментации изображения из записанных последовательностей изображений. Одновременно анализируйте записанные наборы данных, используя одни и те же настройки освещения.
С этой целью назначьте идентификатор и шаблон, которые соответствуют соответствующим именам файлов последовательности изображений для каждого набора данных. Кроме того, определите конкретные наборы данных для специальных целей, таких как записи фидуциальных маркеров для регистрации изображений, световые профили возбуждения для коррекции плоского поля и, при необходимости, образцы только для доноров и только для акцепторов для определения поправочных коэффициентов. Затем выберите каналы излучения и необработанные изображения, если оба канала записаны с помощью одной камеры.
Для этого используйте соответствующий графический виджет для выбора подходящих регионов для донорской и акцепторной эмиссии, затем локализуйте фидуциальные маркеры в обоих каналах излучения и выполняйте регистрацию изображений. Используйте предоставленный пользовательский интерфейс для поиска подходящих параметров для алгоритма локализации как для донорских, так и для акцепторных эмиссионных каналов. Далее задают параметры одномолекулярной локализации для зондов FRET при возбуждении донора в сумме изображений, полученных от донорского и акцепторного излучения, затем задают параметры локализации для зондов при акцепторном возбуждении в акцепторном эмиссионном канале.
Локализуйте зонды FRET при донорском и акцепторном возбуждении независимо во всех кадрах. Результаты объединяются в одну таблицу, содержащую исходный номер кадра, двумерные координаты и идентификатор, относящийся к файлу исходного изображения. Для отслеживания и измерения интенсивности флуоресценции выберите соответствующие параметры алгоритма Trackpy для связывания локализаций зонда FRET с траекториями.
Затем, используя функциональность программного обеспечения для анализа, обрабатывайте вспомогательные данные изображений из последовательностей изображений. Извлеките дополнительные изображения, записанные для облегчения сегментации, отмеченной S в последовательности возбуждения. Наконец, определите световые профили донора и акцептора возбуждения по всему полю зрения по изображениям, записанным на плотно меченом образце.
На начальных этапах фильтрации отбрасывайте сигналы с перекрывающимися функциями точечного распространения, так как трудно надежно определить их интенсивность флуоресценции. В случае неоднородного освещения принимайте только сигналы, расположенные в хорошо освещенных областях в поле зрения, чтобы обеспечить хорошее соотношение сигнал/шум. При изучении внутримолекулярного ФРЕТа ограничьте анализ теми траекториями, которые присутствуют с начала последовательности изображения.
Затем выполните коррекцию плоского поля, которая использует полученные ранее профили источников света возбуждения, чтобы обратить вспять зависящие от положения изменения интенсивности флуоресценции, вызванные неоднородным освещением, а затем вычислить кажущуюся эффективность FRET и кажущуюся стехиометрию. Для выполнения пошагового анализа фотоотбеливания для различения одиночных молекулярных зондов и агрегатов найти соответствующие параметры алгоритма обнаружения точки изменения при возбуждении донора и акцептора независимо друг от друга. Затем выполните алгоритм обнаружения точки изменения.
Чтобы удалить дорожку, показывающую неоднозначное поведение фотоотбеливания, определите пороговые значения интенсивности, ниже которых флуорофор считается обесцвеченным, а затем выберите один из следующих вариантов. Вариант первый, в котором акцептор флуорофор отбеливается за один шаг, в то время как донор не показывает частичного отбеливания. Вариант второй, в котором донор отбеливает в один этап, пока нет частичного акцепторного отбеливания.
Вариант третий, в котором один флуорофор отбеливает за один шаг, в то время как другой не отбеливает частично. И вариант четвертый, в котором донорские и акцепторные флуорофоры показывают одноступенчатое фотоотбеливание или отсутствие фотоотбеливания вообще. Затем рассчитайте поправочные коэффициенты утечки донорского излучения в акцепторный канал, прямого возбуждения акцептора, эффективности обнаружения и эффективности возбуждения.
Затем используйте поправочные коэффициенты для расчета эффективности FRET из кажущейся эффективности и стехиометрии из видимой стехиометрии. Для дальнейшей фильтрации выберите только точки данных до первого события обесцвечивания в каждой траектории. Кроме того, чтобы ограничить анализ одномолекулярными зондами, принимайте только траектории с не менее 75% точек данных в соответствующих пределах стехиометрии.
Затем выполните сегментацию изображений с помощью глобальных или адаптивных методов пороговых значений на соответствующих вспомогательных изображениях, чтобы ограничить анализ отдельными областями в поле зрения. Создайте графики эффективности и стехиометрии, чтобы убедиться, что сигналы неправильной стехиометрии были правильно идентифицированы и удалены. Затем постройте гистограммы эффективности FRET, чтобы обеспечить хорошо установленный обзор распределений эффективности FRET и сгруппируйте гистограммы для удобного сравнения результатов различных экспериментов.
Используя преимущества научных библиотек Python, можно дополнительно оценивать данные в записной книжке, выполняя, например, диффузионный анализ. Визуализация и отслеживание одномолекулярного события FRET показаны здесь. Отфильтрованные события FRET представлены графиками эффективности и стехиометрии в гистограмме эффективности FRET.
Кроме того, параметры подвижности могут быть исследованы путем построения индивидуального траекторионного пути на графике XY или графике среднего квадратного смещения. Выход нашей платформы позволяет нам дополнительно идентифицировать переходы во времени эффективности FRET следов мобильных зондов. Например, оценить конформационные изменения биомолекул.
Используя датчик силы на основе FRET, аналитическая платформа позволила нам количественно оценить одномолекулярные силовые события в иммунологическом синапсе во время ранней передачи сигналов Т-клетками.
